Eri menetelmien soveltaminen selluloosa-sellulaasivuorovaikutuksen tutkimiseen: Lisensiaatintyö

Luonnossa selluloosa hydrolysoituu entsymaattisesti usean sellulaasin yhteisvaikutuksesta. Yksi tehokkaimmista selluloosaa hajottavista organismeista on rihmasieni Trichoderma reesei, jonka tuottamat sellobiohydrolaasit (CBH I ja CBH II) yhdessä useiden endoglukanaasien avulla hajottavat kiteisen selluloosan liukoisiksi oligosakkarideiksi. Sellulaaseilla on kaksiyksikkörakenne: suurempi alayksikkö sisältää aktiivisen keskuksen ja katalysoi liukoisten oligosakkaridien hydrolyysiä. Pienempi noin 36 aminohappoa käsittävä N- tai C-terminaalinen alue muodostaa ns. selluloosaan sitoutuvan yksikön (CBD, cellulose-binding domain), joka lisää entsyymin aktiivisuutta kiteiseen selluloosaan. Selluloosa-sellulaasivuorovaikutusilmiön selvittämisellä on merkitystä paitsi perustutkimuksen myös uusien, selluloosaa sekä sellulaaseja hyödyntävien sovellusten kannalta. VTT:n Kemiantekniikan ja biotekniikan laboratorion, Gentin yliopiston biokemian laboratorion sekä Uppsalan biolääketieteellisen keskuksen (BMC) välisessä yhteistyöprojektissa tutkittiin CBH I:n selluloosaan sitoutuvan yksikön molekulaarista perustaa pääasiassa rakennetutkimuksen avulla. Työ jakautui mutanttien affinitetti-, CD- ja NMR-mittauksiin. Yhteensä tutkittiin kuutta muunneltua CBD:tä (Y5A, P16R, N29A, Y31A, Y32A ja Q34A). Lopuksi mittaustuloksia pyrittiin tarkastelemaan kemometrisella monimuuttuja-analyysillä. Affiniteettimittausten perusteella CBD:n hydrofiilisen sivun aromaattisia renkaita sisältävien aminohappojen vaihtaminen alaniiniksi estää CBD:n sitoutumisen selluloosaan lähes kokonaan. NMR-mittauksilla olemme osoittaneet, että kuuden muunnellun peptidin laskostuminen on hyvin samankaltaista luonnollisen proteiinin kanssa. Muunneltujen CBD:n kemiallisten siirtymien pääosin pienet erot osoittavat, että mutaatiot aiheuttavat vain paikallisia rakennemuutoksia. Kytkeytymisvakioiden avulla saatiin lisätietoa mutanttien käännösten ja beeta-laskosten muutoksista. Tulosten perusteella peptidien alkupäässä on enemmän muutoksia luonnolliseen proteiiniin verrattuna kuin peptidiketjun muissa osissa. Myös diagonaalikuvista tunnistettiin proteiinien sekudaarirakenteita. Y5A:lle, Y31A:lle ja Y32A:lle ratkaistujen rakenteiden samankaltaisuus luonnolliseen proteiiniin verrattuna osoitti kemiallisten siirtymien, diedrikulmien ja lyhyiden etäisyyksien perusteella tehdyt johtopäätökset rakenteiden samankaltaisuudesta oikeiksi. Y5A:lle, Y31A:lle ja Y32A:lle mitatuissa CD-spektreissä oli havaittavissa beeta-laskosrakenteelle tyypillinen negatiiviseen kiertosuuntaan oleva voimakas juova. Mittausaineisto ei soveltunut erityisen hyvin tilastolliseen analyysiin.