Abstract
Luonnossa selluloosa hydrolysoituu entsymaattisesti usean
sellulaasin yhteisvaikutuksesta. Yksi tehokkaimmista
selluloosaa hajottavista organismeista on rihmasieni
Trichoderma reesei, jonka tuottamat sellobiohydrolaasit
(CBH I ja CBH II) yhdessä useiden endoglukanaasien avulla
hajottavat kiteisen selluloosan liukoisiksi
oligosakkarideiksi. Sellulaaseilla on
kaksiyksikkörakenne: suurempi alayksikkö sisältää
aktiivisen keskuksen ja katalysoi liukoisten
oligosakkaridien hydrolyysiä. Pienempi noin 36
aminohappoa käsittävä N- tai C-terminaalinen alue
muodostaa ns. selluloosaan sitoutuvan yksikön (CBD,
cellulose-binding domain), joka lisää entsyymin
aktiivisuutta kiteiseen selluloosaan.
Selluloosa-sellulaasivuorovaikutusilmiön selvittämisellä
on merkitystä paitsi perustutkimuksen myös uusien,
selluloosaa sekä sellulaaseja hyödyntävien sovellusten
kannalta.
VTT:n Kemiantekniikan ja biotekniikan laboratorion,
Gentin yliopiston biokemian laboratorion sekä Uppsalan
biolääketieteellisen keskuksen (BMC) välisessä
yhteistyöprojektissa tutkittiin CBH I:n selluloosaan
sitoutuvan yksikön molekulaarista perustaa pääasiassa
rakennetutkimuksen avulla. Työ jakautui mutanttien
affinitetti-, CD- ja NMR-mittauksiin. Yhteensä tutkittiin
kuutta muunneltua CBD:tä (Y5A, P16R, N29A, Y31A, Y32A ja
Q34A). Lopuksi mittaustuloksia pyrittiin tarkastelemaan
kemometrisella monimuuttuja-analyysillä.
Affiniteettimittausten perusteella CBD:n hydrofiilisen
sivun aromaattisia renkaita sisältävien aminohappojen
vaihtaminen alaniiniksi estää CBD:n sitoutumisen
selluloosaan lähes kokonaan. NMR-mittauksilla olemme
osoittaneet, että kuuden muunnellun peptidin
laskostuminen on hyvin samankaltaista luonnollisen
proteiinin kanssa. Muunneltujen CBD:n kemiallisten
siirtymien pääosin pienet erot osoittavat, että mutaatiot
aiheuttavat vain paikallisia rakennemuutoksia.
Kytkeytymisvakioiden avulla saatiin lisätietoa mutanttien
käännösten ja beeta-laskosten muutoksista. Tulosten
perusteella peptidien alkupäässä on enemmän muutoksia
luonnolliseen proteiiniin verrattuna kuin peptidiketjun
muissa osissa. Myös diagonaalikuvista tunnistettiin
proteiinien sekudaarirakenteita. Y5A:lle, Y31A:lle ja
Y32A:lle ratkaistujen rakenteiden samankaltaisuus
luonnolliseen proteiiniin verrattuna osoitti kemiallisten
siirtymien, diedrikulmien ja lyhyiden etäisyyksien
perusteella tehdyt johtopäätökset rakenteiden
samankaltaisuudesta oikeiksi. Y5A:lle, Y31A:lle ja
Y32A:lle mitatuissa CD-spektreissä oli havaittavissa
beeta-laskosrakenteelle tyypillinen negatiiviseen
kiertosuuntaan oleva voimakas juova. Mittausaineisto ei
soveltunut erityisen hyvin tilastolliseen analyysiin.
Original language | Finnish |
---|---|
Qualification | Licentiate Degree |
Place of Publication | Espoo |
Publisher | |
Print ISBNs | 951-38-4515-X |
Publication status | Published - 1995 |
MoE publication type | G3 Licentiate thesis |
Keywords
- cellulose
- cellulase
- interactions
- NMR and CD spectroscopy
- mutations
- measurement
- methods
- analyzing
- enzymes
- structural analysis of proteins
- biopolymers