Eri menetelmien soveltaminen selluloosa-sellulaasivuorovaikutuksen tutkimiseen

Lisensiaatintyö

Maija-Liisa Mattinen

Research output: ThesisLicenciateTheses

Abstract

Luonnossa selluloosa hydrolysoituu entsymaattisesti usean sellulaasin yhteisvaikutuksesta. Yksi tehokkaimmista selluloosaa hajottavista organismeista on rihmasieni Trichoderma reesei, jonka tuottamat sellobiohydrolaasit (CBH I ja CBH II) yhdessä useiden endoglukanaasien avulla hajottavat kiteisen selluloosan liukoisiksi oligosakkarideiksi. Sellulaaseilla on kaksiyksikkörakenne: suurempi alayksikkö sisältää aktiivisen keskuksen ja katalysoi liukoisten oligosakkaridien hydrolyysiä. Pienempi noin 36 aminohappoa käsittävä N- tai C-terminaalinen alue muodostaa ns. selluloosaan sitoutuvan yksikön (CBD, cellulose-binding domain), joka lisää entsyymin aktiivisuutta kiteiseen selluloosaan. Selluloosa-sellulaasivuorovaikutusilmiön selvittämisellä on merkitystä paitsi perustutkimuksen myös uusien, selluloosaa sekä sellulaaseja hyödyntävien sovellusten kannalta. VTT:n Kemiantekniikan ja biotekniikan laboratorion, Gentin yliopiston biokemian laboratorion sekä Uppsalan biolääketieteellisen keskuksen (BMC) välisessä yhteistyöprojektissa tutkittiin CBH I:n selluloosaan sitoutuvan yksikön molekulaarista perustaa pääasiassa rakennetutkimuksen avulla. Työ jakautui mutanttien affinitetti-, CD- ja NMR-mittauksiin. Yhteensä tutkittiin kuutta muunneltua CBD:tä (Y5A, P16R, N29A, Y31A, Y32A ja Q34A). Lopuksi mittaustuloksia pyrittiin tarkastelemaan kemometrisella monimuuttuja-analyysillä. Affiniteettimittausten perusteella CBD:n hydrofiilisen sivun aromaattisia renkaita sisältävien aminohappojen vaihtaminen alaniiniksi estää CBD:n sitoutumisen selluloosaan lähes kokonaan. NMR-mittauksilla olemme osoittaneet, että kuuden muunnellun peptidin laskostuminen on hyvin samankaltaista luonnollisen proteiinin kanssa. Muunneltujen CBD:n kemiallisten siirtymien pääosin pienet erot osoittavat, että mutaatiot aiheuttavat vain paikallisia rakennemuutoksia. Kytkeytymisvakioiden avulla saatiin lisätietoa mutanttien käännösten ja beeta-laskosten muutoksista. Tulosten perusteella peptidien alkupäässä on enemmän muutoksia luonnolliseen proteiiniin verrattuna kuin peptidiketjun muissa osissa. Myös diagonaalikuvista tunnistettiin proteiinien sekudaarirakenteita. Y5A:lle, Y31A:lle ja Y32A:lle ratkaistujen rakenteiden samankaltaisuus luonnolliseen proteiiniin verrattuna osoitti kemiallisten siirtymien, diedrikulmien ja lyhyiden etäisyyksien perusteella tehdyt johtopäätökset rakenteiden samankaltaisuudesta oikeiksi. Y5A:lle, Y31A:lle ja Y32A:lle mitatuissa CD-spektreissä oli havaittavissa beeta-laskosrakenteelle tyypillinen negatiiviseen kiertosuuntaan oleva voimakas juova. Mittausaineisto ei soveltunut erityisen hyvin tilastolliseen analyysiin.
Original languageFinnish
QualificationLicentiate Degree
Place of PublicationEspoo
Publisher
Print ISBNs951-38-4515-X
Publication statusPublished - 1995
MoE publication typeG3 Licentiate thesis

Fingerprint

Cellulase
Cellulose
Trichoderma

Keywords

  • cellulose
  • cellulase
  • interactions
  • NMR and CD spectroscopy
  • mutations
  • measurement
  • methods
  • analyzing
  • enzymes
  • structural analysis of proteins
  • biopolymers

Cite this

Mattinen, M-L. (1995). Eri menetelmien soveltaminen selluloosa-sellulaasivuorovaikutuksen tutkimiseen: Lisensiaatintyö. Espoo: VTT Technical Research Centre of Finland.
Mattinen, Maija-Liisa. / Eri menetelmien soveltaminen selluloosa-sellulaasivuorovaikutuksen tutkimiseen : Lisensiaatintyö. Espoo : VTT Technical Research Centre of Finland, 1995. 132 p.
@phdthesis{26f6848bfb924445bd93b14f7f6bb9ee,
title = "Eri menetelmien soveltaminen selluloosa-sellulaasivuorovaikutuksen tutkimiseen: Lisensiaatinty{\"o}",
abstract = "Luonnossa selluloosa hydrolysoituu entsymaattisesti usean sellulaasin yhteisvaikutuksesta. Yksi tehokkaimmista selluloosaa hajottavista organismeista on rihmasieni Trichoderma reesei, jonka tuottamat sellobiohydrolaasit (CBH I ja CBH II) yhdess{\"a} useiden endoglukanaasien avulla hajottavat kiteisen selluloosan liukoisiksi oligosakkarideiksi. Sellulaaseilla on kaksiyksikk{\"o}rakenne: suurempi alayksikk{\"o} sis{\"a}lt{\"a}{\"a} aktiivisen keskuksen ja katalysoi liukoisten oligosakkaridien hydrolyysi{\"a}. Pienempi noin 36 aminohappoa k{\"a}sitt{\"a}v{\"a} N- tai C-terminaalinen alue muodostaa ns. selluloosaan sitoutuvan yksik{\"o}n (CBD, cellulose-binding domain), joka lis{\"a}{\"a} entsyymin aktiivisuutta kiteiseen selluloosaan. Selluloosa-sellulaasivuorovaikutusilmi{\"o}n selvitt{\"a}misell{\"a} on merkityst{\"a} paitsi perustutkimuksen my{\"o}s uusien, selluloosaa sek{\"a} sellulaaseja hy{\"o}dynt{\"a}vien sovellusten kannalta. VTT:n Kemiantekniikan ja biotekniikan laboratorion, Gentin yliopiston biokemian laboratorion sek{\"a} Uppsalan biol{\"a}{\"a}ketieteellisen keskuksen (BMC) v{\"a}lisess{\"a} yhteisty{\"o}projektissa tutkittiin CBH I:n selluloosaan sitoutuvan yksik{\"o}n molekulaarista perustaa p{\"a}{\"a}asiassa rakennetutkimuksen avulla. Ty{\"o} jakautui mutanttien affinitetti-, CD- ja NMR-mittauksiin. Yhteens{\"a} tutkittiin kuutta muunneltua CBD:t{\"a} (Y5A, P16R, N29A, Y31A, Y32A ja Q34A). Lopuksi mittaustuloksia pyrittiin tarkastelemaan kemometrisella monimuuttuja-analyysill{\"a}. Affiniteettimittausten perusteella CBD:n hydrofiilisen sivun aromaattisia renkaita sis{\"a}lt{\"a}vien aminohappojen vaihtaminen alaniiniksi est{\"a}{\"a} CBD:n sitoutumisen selluloosaan l{\"a}hes kokonaan. NMR-mittauksilla olemme osoittaneet, ett{\"a} kuuden muunnellun peptidin laskostuminen on hyvin samankaltaista luonnollisen proteiinin kanssa. Muunneltujen CBD:n kemiallisten siirtymien p{\"a}{\"a}osin pienet erot osoittavat, ett{\"a} mutaatiot aiheuttavat vain paikallisia rakennemuutoksia. Kytkeytymisvakioiden avulla saatiin lis{\"a}tietoa mutanttien k{\"a}{\"a}nn{\"o}sten ja beeta-laskosten muutoksista. Tulosten perusteella peptidien alkup{\"a}{\"a}ss{\"a} on enemm{\"a}n muutoksia luonnolliseen proteiiniin verrattuna kuin peptidiketjun muissa osissa. My{\"o}s diagonaalikuvista tunnistettiin proteiinien sekudaarirakenteita. Y5A:lle, Y31A:lle ja Y32A:lle ratkaistujen rakenteiden samankaltaisuus luonnolliseen proteiiniin verrattuna osoitti kemiallisten siirtymien, diedrikulmien ja lyhyiden et{\"a}isyyksien perusteella tehdyt johtop{\"a}{\"a}t{\"o}kset rakenteiden samankaltaisuudesta oikeiksi. Y5A:lle, Y31A:lle ja Y32A:lle mitatuissa CD-spektreiss{\"a} oli havaittavissa beeta-laskosrakenteelle tyypillinen negatiiviseen kiertosuuntaan oleva voimakas juova. Mittausaineisto ei soveltunut erityisen hyvin tilastolliseen analyysiin.",
keywords = "cellulose, cellulase, interactions, NMR and CD spectroscopy, mutations, measurement, methods, analyzing, enzymes, structural analysis of proteins, biopolymers",
author = "Maija-Liisa Mattinen",
year = "1995",
language = "Finnish",
isbn = "951-38-4515-X",
series = "VTT Julkaisuja - Publikationer",
publisher = "VTT Technical Research Centre of Finland",
address = "Finland",

}

Eri menetelmien soveltaminen selluloosa-sellulaasivuorovaikutuksen tutkimiseen : Lisensiaatintyö. / Mattinen, Maija-Liisa.

Espoo : VTT Technical Research Centre of Finland, 1995. 132 p.

Research output: ThesisLicenciateTheses

TY - THES

T1 - Eri menetelmien soveltaminen selluloosa-sellulaasivuorovaikutuksen tutkimiseen

T2 - Lisensiaatintyö

AU - Mattinen, Maija-Liisa

PY - 1995

Y1 - 1995

N2 - Luonnossa selluloosa hydrolysoituu entsymaattisesti usean sellulaasin yhteisvaikutuksesta. Yksi tehokkaimmista selluloosaa hajottavista organismeista on rihmasieni Trichoderma reesei, jonka tuottamat sellobiohydrolaasit (CBH I ja CBH II) yhdessä useiden endoglukanaasien avulla hajottavat kiteisen selluloosan liukoisiksi oligosakkarideiksi. Sellulaaseilla on kaksiyksikkörakenne: suurempi alayksikkö sisältää aktiivisen keskuksen ja katalysoi liukoisten oligosakkaridien hydrolyysiä. Pienempi noin 36 aminohappoa käsittävä N- tai C-terminaalinen alue muodostaa ns. selluloosaan sitoutuvan yksikön (CBD, cellulose-binding domain), joka lisää entsyymin aktiivisuutta kiteiseen selluloosaan. Selluloosa-sellulaasivuorovaikutusilmiön selvittämisellä on merkitystä paitsi perustutkimuksen myös uusien, selluloosaa sekä sellulaaseja hyödyntävien sovellusten kannalta. VTT:n Kemiantekniikan ja biotekniikan laboratorion, Gentin yliopiston biokemian laboratorion sekä Uppsalan biolääketieteellisen keskuksen (BMC) välisessä yhteistyöprojektissa tutkittiin CBH I:n selluloosaan sitoutuvan yksikön molekulaarista perustaa pääasiassa rakennetutkimuksen avulla. Työ jakautui mutanttien affinitetti-, CD- ja NMR-mittauksiin. Yhteensä tutkittiin kuutta muunneltua CBD:tä (Y5A, P16R, N29A, Y31A, Y32A ja Q34A). Lopuksi mittaustuloksia pyrittiin tarkastelemaan kemometrisella monimuuttuja-analyysillä. Affiniteettimittausten perusteella CBD:n hydrofiilisen sivun aromaattisia renkaita sisältävien aminohappojen vaihtaminen alaniiniksi estää CBD:n sitoutumisen selluloosaan lähes kokonaan. NMR-mittauksilla olemme osoittaneet, että kuuden muunnellun peptidin laskostuminen on hyvin samankaltaista luonnollisen proteiinin kanssa. Muunneltujen CBD:n kemiallisten siirtymien pääosin pienet erot osoittavat, että mutaatiot aiheuttavat vain paikallisia rakennemuutoksia. Kytkeytymisvakioiden avulla saatiin lisätietoa mutanttien käännösten ja beeta-laskosten muutoksista. Tulosten perusteella peptidien alkupäässä on enemmän muutoksia luonnolliseen proteiiniin verrattuna kuin peptidiketjun muissa osissa. Myös diagonaalikuvista tunnistettiin proteiinien sekudaarirakenteita. Y5A:lle, Y31A:lle ja Y32A:lle ratkaistujen rakenteiden samankaltaisuus luonnolliseen proteiiniin verrattuna osoitti kemiallisten siirtymien, diedrikulmien ja lyhyiden etäisyyksien perusteella tehdyt johtopäätökset rakenteiden samankaltaisuudesta oikeiksi. Y5A:lle, Y31A:lle ja Y32A:lle mitatuissa CD-spektreissä oli havaittavissa beeta-laskosrakenteelle tyypillinen negatiiviseen kiertosuuntaan oleva voimakas juova. Mittausaineisto ei soveltunut erityisen hyvin tilastolliseen analyysiin.

AB - Luonnossa selluloosa hydrolysoituu entsymaattisesti usean sellulaasin yhteisvaikutuksesta. Yksi tehokkaimmista selluloosaa hajottavista organismeista on rihmasieni Trichoderma reesei, jonka tuottamat sellobiohydrolaasit (CBH I ja CBH II) yhdessä useiden endoglukanaasien avulla hajottavat kiteisen selluloosan liukoisiksi oligosakkarideiksi. Sellulaaseilla on kaksiyksikkörakenne: suurempi alayksikkö sisältää aktiivisen keskuksen ja katalysoi liukoisten oligosakkaridien hydrolyysiä. Pienempi noin 36 aminohappoa käsittävä N- tai C-terminaalinen alue muodostaa ns. selluloosaan sitoutuvan yksikön (CBD, cellulose-binding domain), joka lisää entsyymin aktiivisuutta kiteiseen selluloosaan. Selluloosa-sellulaasivuorovaikutusilmiön selvittämisellä on merkitystä paitsi perustutkimuksen myös uusien, selluloosaa sekä sellulaaseja hyödyntävien sovellusten kannalta. VTT:n Kemiantekniikan ja biotekniikan laboratorion, Gentin yliopiston biokemian laboratorion sekä Uppsalan biolääketieteellisen keskuksen (BMC) välisessä yhteistyöprojektissa tutkittiin CBH I:n selluloosaan sitoutuvan yksikön molekulaarista perustaa pääasiassa rakennetutkimuksen avulla. Työ jakautui mutanttien affinitetti-, CD- ja NMR-mittauksiin. Yhteensä tutkittiin kuutta muunneltua CBD:tä (Y5A, P16R, N29A, Y31A, Y32A ja Q34A). Lopuksi mittaustuloksia pyrittiin tarkastelemaan kemometrisella monimuuttuja-analyysillä. Affiniteettimittausten perusteella CBD:n hydrofiilisen sivun aromaattisia renkaita sisältävien aminohappojen vaihtaminen alaniiniksi estää CBD:n sitoutumisen selluloosaan lähes kokonaan. NMR-mittauksilla olemme osoittaneet, että kuuden muunnellun peptidin laskostuminen on hyvin samankaltaista luonnollisen proteiinin kanssa. Muunneltujen CBD:n kemiallisten siirtymien pääosin pienet erot osoittavat, että mutaatiot aiheuttavat vain paikallisia rakennemuutoksia. Kytkeytymisvakioiden avulla saatiin lisätietoa mutanttien käännösten ja beeta-laskosten muutoksista. Tulosten perusteella peptidien alkupäässä on enemmän muutoksia luonnolliseen proteiiniin verrattuna kuin peptidiketjun muissa osissa. Myös diagonaalikuvista tunnistettiin proteiinien sekudaarirakenteita. Y5A:lle, Y31A:lle ja Y32A:lle ratkaistujen rakenteiden samankaltaisuus luonnolliseen proteiiniin verrattuna osoitti kemiallisten siirtymien, diedrikulmien ja lyhyiden etäisyyksien perusteella tehdyt johtopäätökset rakenteiden samankaltaisuudesta oikeiksi. Y5A:lle, Y31A:lle ja Y32A:lle mitatuissa CD-spektreissä oli havaittavissa beeta-laskosrakenteelle tyypillinen negatiiviseen kiertosuuntaan oleva voimakas juova. Mittausaineisto ei soveltunut erityisen hyvin tilastolliseen analyysiin.

KW - cellulose

KW - cellulase

KW - interactions

KW - NMR and CD spectroscopy

KW - mutations

KW - measurement

KW - methods

KW - analyzing

KW - enzymes

KW - structural analysis of proteins

KW - biopolymers

M3 - Licenciate

SN - 951-38-4515-X

T3 - VTT Julkaisuja - Publikationer

PB - VTT Technical Research Centre of Finland

CY - Espoo

ER -

Mattinen M-L. Eri menetelmien soveltaminen selluloosa-sellulaasivuorovaikutuksen tutkimiseen: Lisensiaatintyö. Espoo: VTT Technical Research Centre of Finland, 1995. 132 p.