Melanocarpus albomyces –lakkaasin C-terminuksen mutagenisointi: Pro gradu

Erkko Ylösmäki

Melanocarpus albomyces –lakkaasin C-terminuksen mutagenisointi: Pro gradu

Erkko Ylösmäki

VTT Technical Research Centre of Finland

Research output: Thesis › Master's thesis

Abstract

Tutkielman kirjallisessa osassa tarkastellaan ensin tunnetuimpia sini-kuparioksidaaseja yleisellä tasolla, jonka jälkeen tarkastellaan lakkaaseja, niiden evoluutiota, toimintaa ja levinneisyyttä hieman lähemmin. Tämän jälkeen keskitytään sienten lakkaasien ominaisuuksien, geenisekvenssien, kiderakenteiden seka toimintamekanismin tarkasteluun. Melanocarpus albomyces -lakkaasin ominaisuuksia, lakkaasigeeniä, ja sen kloonausta seka M. albomyces -lakkaasin rakennetta tarkastellaan yksityiskohtaisesti. Lopuksi käydään läpi lakkaasien heterologiseen tuottoon sekä lakkaasien mahdollisiin teollisiin sovelluksiin liittyvää kirjallisuutta. Tutkielman kokeellinen osa suoritettiin VTT Biotekniikan Homeiden molekyylibiologia- ja Entsyymitekniikka-tutkimusryhmissä Markku Saloheimon ja Kristiina Kruusin ohjauksessa. Kokeellisessa osassa kerrotaan ensin kahden ekspressiokonstruktin tuotosta Trichoderma reeseissä sekä konstruktien analysoinnista immunoblottauksen avulla. Toisessa konstruktissa oli pelkkä M. albomyces -lakkaasin (MaL) cDNA, ja toisessa MaL:n cDNA fuusioituna hfpl-geenin kanssa. Tutkimuksessa havaittiin, että HFB1-lakkaasi-fuusioproteiini pilkkoutuu jo solun sisällä, eikä intaktia fuusioproteiinia näyttänyt erittyvän kasvuliuokseen. Tutkimuksen toisessa osassa kerrotaan neljän erilaisen C-terminaalisen lakkaasimutantin DNA-konstruktien valmistuksesta, niiden transformoinnista Trichoderma reeseihin, mutanttiproteiinien tuotosta, puhdistuksesta sekä aktiivisuusmäärityksistä. Tutkimuksessa kävi ilmi, että kolmella lakkaasimutantilla (M1, M2 ja M4) oli selvä vaikutus proteiinin tuottoon T. reeseissä. M1- ja M2-lakkaasimutantit olivat myös osittain hajonneina kasvuliuoksessa, joka viittaisi siihen, etta lakkaasimutantit ovat villityypin lakkaasia herkempiä T. reesein tuottamille proteaaseille. Lisäksi kävi ilmi, että M1-, M2- ja M4-lakkaasimutanttien katalyyttinen aktiivisuus oli selvästi villityypin lakkaasia matalampaa. M3-mutaatiolla ei ollut selvää vaikutusta lakkaasin tuottoon eikä sen katalyyttiseen aktiivisuuteen. M3-mutaatio näytti kuitenkin muuttavan lakkaasin prosessointia, sillä C-terminaalisen sekvensoinnin tuloksista voitiin päätellä, että SDS-PAGE geelillä puhtaalta näyttänyt näyte sisälsi monia eri kohdista pilkottuja proteiinipopulaatioita.

Original language	Finnish
Qualification	Master Degree
Awarding Institution	University of Helsinki
Place of Publication	Helsinki
Publisher	University of Helsinki
Publication status	Published - 2005
MoE publication type	G2 Master's thesis, polytechnic Master's thesis

Cite this

@mastersthesis{169d3824f23b44fd8b70b53c649b9cb7,

title = "Melanocarpus albomyces –lakkaasin C-terminuksen mutagenisointi: Pro gradu",

abstract = "Tutkielman kirjallisessa osassa tarkastellaan ensin tunnetuimpia sini-kuparioksidaaseja yleisell{\"a} tasolla, jonka j{\"a}lkeen tarkastellaan lakkaaseja, niiden evoluutiota, toimintaa ja levinneisyytt{\"a} hieman l{\"a}hemmin. T{\"a}m{\"a}n j{\"a}lkeen keskityt{\"a}{\"a}n sienten lakkaasien ominaisuuksien, geenisekvenssien, kiderakenteiden seka toimintamekanismin tarkasteluun. Melanocarpus albomyces -lakkaasin ominaisuuksia, lakkaasigeeni{\"a}, ja sen kloonausta seka M. albomyces -lakkaasin rakennetta tarkastellaan yksityiskohtaisesti. Lopuksi k{\"a}yd{\"a}{\"a}n l{\"a}pi lakkaasien heterologiseen tuottoon sek{\"a} lakkaasien mahdollisiin teollisiin sovelluksiin liittyv{\"a}{\"a} kirjallisuutta. Tutkielman kokeellinen osa suoritettiin VTT Biotekniikan Homeiden molekyylibiologia- ja Entsyymitekniikka-tutkimusryhmiss{\"a} Markku Saloheimon ja Kristiina Kruusin ohjauksessa. Kokeellisessa osassa kerrotaan ensin kahden ekspressiokonstruktin tuotosta Trichoderma reeseiss{\"a} sek{\"a} konstruktien analysoinnista immunoblottauksen avulla. Toisessa konstruktissa oli pelkk{\"a} M. albomyces -lakkaasin (MaL) cDNA, ja toisessa MaL:n cDNA fuusioituna hfpl-geenin kanssa. Tutkimuksessa havaittiin, ett{\"a} HFB1-lakkaasi-fuusioproteiini pilkkoutuu jo solun sis{\"a}ll{\"a}, eik{\"a} intaktia fuusioproteiinia n{\"a}ytt{\"a}nyt erittyv{\"a}n kasvuliuokseen. Tutkimuksen toisessa osassa kerrotaan nelj{\"a}n erilaisen C-terminaalisen lakkaasimutantin DNA-konstruktien valmistuksesta, niiden transformoinnista Trichoderma reeseihin, mutanttiproteiinien tuotosta, puhdistuksesta sek{\"a} aktiivisuusm{\"a}{\"a}rityksist{\"a}. Tutkimuksessa k{\"a}vi ilmi, ett{\"a} kolmella lakkaasimutantilla (M1, M2 ja M4) oli selv{\"a} vaikutus proteiinin tuottoon T. reeseiss{\"a}. M1- ja M2-lakkaasimutantit olivat my{\"o}s osittain hajonneina kasvuliuoksessa, joka viittaisi siihen, etta lakkaasimutantit ovat villityypin lakkaasia herkempi{\"a} T. reesein tuottamille proteaaseille. Lis{\"a}ksi k{\"a}vi ilmi, ett{\"a} M1-, M2- ja M4-lakkaasimutanttien katalyyttinen aktiivisuus oli selv{\"a}sti villityypin lakkaasia matalampaa. M3-mutaatiolla ei ollut selv{\"a}{\"a} vaikutusta lakkaasin tuottoon eik{\"a} sen katalyyttiseen aktiivisuuteen. M3-mutaatio n{\"a}ytti kuitenkin muuttavan lakkaasin prosessointia, sill{\"a} C-terminaalisen sekvensoinnin tuloksista voitiin p{\"a}{\"a}tell{\"a}, ett{\"a} SDS-PAGE geelill{\"a} puhtaalta n{\"a}ytt{\"a}nyt n{\"a}yte sis{\"a}lsi monia eri kohdista pilkottuja proteiinipopulaatioita.",

author = "Erkko Yl{\"o}sm{\"a}ki",

note = "CA: BEL pro gradu Helsingin yliopisto, Bio- ja ymp{\"a}rist{\"o}tieteiden laitos, Perinn{\"o}llisyystiede",

year = "2005",

language = "Finnish",

publisher = "University of Helsinki",

address = "Finland",

school = "University of Helsinki",

}

TY - THES

T1 - Melanocarpus albomyces –lakkaasin C-terminuksen mutagenisointi

T2 - Pro gradu

AU - Ylösmäki, Erkko

N1 - CA: BEL pro gradu Helsingin yliopisto, Bio- ja ympäristötieteiden laitos, Perinnöllisyystiede

PY - 2005

Y1 - 2005

N2 - Tutkielman kirjallisessa osassa tarkastellaan ensin tunnetuimpia sini-kuparioksidaaseja yleisellä tasolla, jonka jälkeen tarkastellaan lakkaaseja, niiden evoluutiota, toimintaa ja levinneisyyttä hieman lähemmin. Tämän jälkeen keskitytään sienten lakkaasien ominaisuuksien, geenisekvenssien, kiderakenteiden seka toimintamekanismin tarkasteluun. Melanocarpus albomyces -lakkaasin ominaisuuksia, lakkaasigeeniä, ja sen kloonausta seka M. albomyces -lakkaasin rakennetta tarkastellaan yksityiskohtaisesti. Lopuksi käydään läpi lakkaasien heterologiseen tuottoon sekä lakkaasien mahdollisiin teollisiin sovelluksiin liittyvää kirjallisuutta. Tutkielman kokeellinen osa suoritettiin VTT Biotekniikan Homeiden molekyylibiologia- ja Entsyymitekniikka-tutkimusryhmissä Markku Saloheimon ja Kristiina Kruusin ohjauksessa. Kokeellisessa osassa kerrotaan ensin kahden ekspressiokonstruktin tuotosta Trichoderma reeseissä sekä konstruktien analysoinnista immunoblottauksen avulla. Toisessa konstruktissa oli pelkkä M. albomyces -lakkaasin (MaL) cDNA, ja toisessa MaL:n cDNA fuusioituna hfpl-geenin kanssa. Tutkimuksessa havaittiin, että HFB1-lakkaasi-fuusioproteiini pilkkoutuu jo solun sisällä, eikä intaktia fuusioproteiinia näyttänyt erittyvän kasvuliuokseen. Tutkimuksen toisessa osassa kerrotaan neljän erilaisen C-terminaalisen lakkaasimutantin DNA-konstruktien valmistuksesta, niiden transformoinnista Trichoderma reeseihin, mutanttiproteiinien tuotosta, puhdistuksesta sekä aktiivisuusmäärityksistä. Tutkimuksessa kävi ilmi, että kolmella lakkaasimutantilla (M1, M2 ja M4) oli selvä vaikutus proteiinin tuottoon T. reeseissä. M1- ja M2-lakkaasimutantit olivat myös osittain hajonneina kasvuliuoksessa, joka viittaisi siihen, etta lakkaasimutantit ovat villityypin lakkaasia herkempiä T. reesein tuottamille proteaaseille. Lisäksi kävi ilmi, että M1-, M2- ja M4-lakkaasimutanttien katalyyttinen aktiivisuus oli selvästi villityypin lakkaasia matalampaa. M3-mutaatiolla ei ollut selvää vaikutusta lakkaasin tuottoon eikä sen katalyyttiseen aktiivisuuteen. M3-mutaatio näytti kuitenkin muuttavan lakkaasin prosessointia, sillä C-terminaalisen sekvensoinnin tuloksista voitiin päätellä, että SDS-PAGE geelillä puhtaalta näyttänyt näyte sisälsi monia eri kohdista pilkottuja proteiinipopulaatioita.

AB - Tutkielman kirjallisessa osassa tarkastellaan ensin tunnetuimpia sini-kuparioksidaaseja yleisellä tasolla, jonka jälkeen tarkastellaan lakkaaseja, niiden evoluutiota, toimintaa ja levinneisyyttä hieman lähemmin. Tämän jälkeen keskitytään sienten lakkaasien ominaisuuksien, geenisekvenssien, kiderakenteiden seka toimintamekanismin tarkasteluun. Melanocarpus albomyces -lakkaasin ominaisuuksia, lakkaasigeeniä, ja sen kloonausta seka M. albomyces -lakkaasin rakennetta tarkastellaan yksityiskohtaisesti. Lopuksi käydään läpi lakkaasien heterologiseen tuottoon sekä lakkaasien mahdollisiin teollisiin sovelluksiin liittyvää kirjallisuutta. Tutkielman kokeellinen osa suoritettiin VTT Biotekniikan Homeiden molekyylibiologia- ja Entsyymitekniikka-tutkimusryhmissä Markku Saloheimon ja Kristiina Kruusin ohjauksessa. Kokeellisessa osassa kerrotaan ensin kahden ekspressiokonstruktin tuotosta Trichoderma reeseissä sekä konstruktien analysoinnista immunoblottauksen avulla. Toisessa konstruktissa oli pelkkä M. albomyces -lakkaasin (MaL) cDNA, ja toisessa MaL:n cDNA fuusioituna hfpl-geenin kanssa. Tutkimuksessa havaittiin, että HFB1-lakkaasi-fuusioproteiini pilkkoutuu jo solun sisällä, eikä intaktia fuusioproteiinia näyttänyt erittyvän kasvuliuokseen. Tutkimuksen toisessa osassa kerrotaan neljän erilaisen C-terminaalisen lakkaasimutantin DNA-konstruktien valmistuksesta, niiden transformoinnista Trichoderma reeseihin, mutanttiproteiinien tuotosta, puhdistuksesta sekä aktiivisuusmäärityksistä. Tutkimuksessa kävi ilmi, että kolmella lakkaasimutantilla (M1, M2 ja M4) oli selvä vaikutus proteiinin tuottoon T. reeseissä. M1- ja M2-lakkaasimutantit olivat myös osittain hajonneina kasvuliuoksessa, joka viittaisi siihen, etta lakkaasimutantit ovat villityypin lakkaasia herkempiä T. reesein tuottamille proteaaseille. Lisäksi kävi ilmi, että M1-, M2- ja M4-lakkaasimutanttien katalyyttinen aktiivisuus oli selvästi villityypin lakkaasia matalampaa. M3-mutaatiolla ei ollut selvää vaikutusta lakkaasin tuottoon eikä sen katalyyttiseen aktiivisuuteen. M3-mutaatio näytti kuitenkin muuttavan lakkaasin prosessointia, sillä C-terminaalisen sekvensoinnin tuloksista voitiin päätellä, että SDS-PAGE geelillä puhtaalta näyttänyt näyte sisälsi monia eri kohdista pilkottuja proteiinipopulaatioita.

M3 - Master's thesis

PB - University of Helsinki

CY - Helsinki

ER -