Melanocarpus albomyces –lakkaasin C-terminuksen mutagenisointi: Pro gradu

Erkko Ylösmäki

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

Abstract

Tutkielman kirjallisessa osassa tarkastellaan ensin tunnetuimpia sini-kuparioksidaaseja yleisellä tasolla, jonka jälkeen tarkastellaan lakkaaseja, niiden evoluutiota, toimintaa ja levinneisyyttä hieman lähemmin. Tämän jälkeen keskitytään sienten lakkaasien ominaisuuksien, geenisekvenssien, kiderakenteiden seka toimintamekanismin tarkasteluun. Melanocarpus albomyces -lakkaasin ominaisuuksia, lakkaasigeeniä, ja sen kloonausta seka M. albomyces -lakkaasin rakennetta tarkastellaan yksityiskohtaisesti. Lopuksi käydään läpi lakkaasien heterologiseen tuottoon sekä lakkaasien mahdollisiin teollisiin sovelluksiin liittyvää kirjallisuutta. Tutkielman kokeellinen osa suoritettiin VTT Biotekniikan Homeiden molekyylibiologia- ja Entsyymitekniikka-tutkimusryhmissä Markku Saloheimon ja Kristiina Kruusin ohjauksessa. Kokeellisessa osassa kerrotaan ensin kahden ekspressiokonstruktin tuotosta Trichoderma reeseissä sekä konstruktien analysoinnista immunoblottauksen avulla. Toisessa konstruktissa oli pelkkä M. albomyces -lakkaasin (MaL) cDNA, ja toisessa MaL:n cDNA fuusioituna hfpl-geenin kanssa. Tutkimuksessa havaittiin, että HFB1-lakkaasi-fuusioproteiini pilkkoutuu jo solun sisällä, eikä intaktia fuusioproteiinia näyttänyt erittyvän kasvuliuokseen. Tutkimuksen toisessa osassa kerrotaan neljän erilaisen C-terminaalisen lakkaasimutantin DNA-konstruktien valmistuksesta, niiden transformoinnista Trichoderma reeseihin, mutanttiproteiinien tuotosta, puhdistuksesta sekä aktiivisuusmäärityksistä. Tutkimuksessa kävi ilmi, että kolmella lakkaasimutantilla (M1, M2 ja M4) oli selvä vaikutus proteiinin tuottoon T. reeseissä. M1- ja M2-lakkaasimutantit olivat myös osittain hajonneina kasvuliuoksessa, joka viittaisi siihen, etta lakkaasimutantit ovat villityypin lakkaasia herkempiä T. reesein tuottamille proteaaseille. Lisäksi kävi ilmi, että M1-, M2- ja M4-lakkaasimutanttien katalyyttinen aktiivisuus oli selvästi villityypin lakkaasia matalampaa. M3-mutaatiolla ei ollut selvää vaikutusta lakkaasin tuottoon eikä sen katalyyttiseen aktiivisuuteen. M3-mutaatio näytti kuitenkin muuttavan lakkaasin prosessointia, sillä C-terminaalisen sekvensoinnin tuloksista voitiin päätellä, että SDS-PAGE geelillä puhtaalta näyttänyt näyte sisälsi monia eri kohdista pilkottuja proteiinipopulaatioita.
Original languageFinnish
QualificationMaster Degree
Awarding Institution
  • University of Helsinki
Place of PublicationHelsinki
Publisher
Publication statusPublished - 2005
MoE publication typeG2 Master's thesis, polytechnic Master's thesis

Cite this