Melanocarpus albomyces –lakkaasin C-terminuksen mutagenisointi: Pro gradu

Erkko Ylösmäki

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

Abstract

Tutkielman kirjallisessa osassa tarkastellaan ensin tunnetuimpia sini-kuparioksidaaseja yleisellä tasolla, jonka jälkeen tarkastellaan lakkaaseja, niiden evoluutiota, toimintaa ja levinneisyyttä hieman lähemmin. Tämän jälkeen keskitytään sienten lakkaasien ominaisuuksien, geenisekvenssien, kiderakenteiden seka toimintamekanismin tarkasteluun. Melanocarpus albomyces -lakkaasin ominaisuuksia, lakkaasigeeniä, ja sen kloonausta seka M. albomyces -lakkaasin rakennetta tarkastellaan yksityiskohtaisesti. Lopuksi käydään läpi lakkaasien heterologiseen tuottoon sekä lakkaasien mahdollisiin teollisiin sovelluksiin liittyvää kirjallisuutta. Tutkielman kokeellinen osa suoritettiin VTT Biotekniikan Homeiden molekyylibiologia- ja Entsyymitekniikka-tutkimusryhmissä Markku Saloheimon ja Kristiina Kruusin ohjauksessa. Kokeellisessa osassa kerrotaan ensin kahden ekspressiokonstruktin tuotosta Trichoderma reeseissä sekä konstruktien analysoinnista immunoblottauksen avulla. Toisessa konstruktissa oli pelkkä M. albomyces -lakkaasin (MaL) cDNA, ja toisessa MaL:n cDNA fuusioituna hfpl-geenin kanssa. Tutkimuksessa havaittiin, että HFB1-lakkaasi-fuusioproteiini pilkkoutuu jo solun sisällä, eikä intaktia fuusioproteiinia näyttänyt erittyvän kasvuliuokseen. Tutkimuksen toisessa osassa kerrotaan neljän erilaisen C-terminaalisen lakkaasimutantin DNA-konstruktien valmistuksesta, niiden transformoinnista Trichoderma reeseihin, mutanttiproteiinien tuotosta, puhdistuksesta sekä aktiivisuusmäärityksistä. Tutkimuksessa kävi ilmi, että kolmella lakkaasimutantilla (M1, M2 ja M4) oli selvä vaikutus proteiinin tuottoon T. reeseissä. M1- ja M2-lakkaasimutantit olivat myös osittain hajonneina kasvuliuoksessa, joka viittaisi siihen, etta lakkaasimutantit ovat villityypin lakkaasia herkempiä T. reesein tuottamille proteaaseille. Lisäksi kävi ilmi, että M1-, M2- ja M4-lakkaasimutanttien katalyyttinen aktiivisuus oli selvästi villityypin lakkaasia matalampaa. M3-mutaatiolla ei ollut selvää vaikutusta lakkaasin tuottoon eikä sen katalyyttiseen aktiivisuuteen. M3-mutaatio näytti kuitenkin muuttavan lakkaasin prosessointia, sillä C-terminaalisen sekvensoinnin tuloksista voitiin päätellä, että SDS-PAGE geelillä puhtaalta näyttänyt näyte sisälsi monia eri kohdista pilkottuja proteiinipopulaatioita.
Original languageFinnish
QualificationMaster Degree
Awarding Institution
  • University of Helsinki
Place of PublicationHelsinki
Publisher
Publication statusPublished - 2005
MoE publication typeG2 Master's thesis, polytechnic Master's thesis

Cite this

Ylösmäki, E. (2005). Melanocarpus albomyces –lakkaasin C-terminuksen mutagenisointi: Pro gradu. Helsinki: University of Helsinki.
Ylösmäki, Erkko. / Melanocarpus albomyces –lakkaasin C-terminuksen mutagenisointi : Pro gradu. Helsinki : University of Helsinki, 2005. 64 p.
@phdthesis{169d3824f23b44fd8b70b53c649b9cb7,
title = "Melanocarpus albomyces –lakkaasin C-terminuksen mutagenisointi: Pro gradu",
abstract = "Tutkielman kirjallisessa osassa tarkastellaan ensin tunnetuimpia sini-kuparioksidaaseja yleisell{\"a} tasolla, jonka j{\"a}lkeen tarkastellaan lakkaaseja, niiden evoluutiota, toimintaa ja levinneisyytt{\"a} hieman l{\"a}hemmin. T{\"a}m{\"a}n j{\"a}lkeen keskityt{\"a}{\"a}n sienten lakkaasien ominaisuuksien, geenisekvenssien, kiderakenteiden seka toimintamekanismin tarkasteluun. Melanocarpus albomyces -lakkaasin ominaisuuksia, lakkaasigeeni{\"a}, ja sen kloonausta seka M. albomyces -lakkaasin rakennetta tarkastellaan yksityiskohtaisesti. Lopuksi k{\"a}yd{\"a}{\"a}n l{\"a}pi lakkaasien heterologiseen tuottoon sek{\"a} lakkaasien mahdollisiin teollisiin sovelluksiin liittyv{\"a}{\"a} kirjallisuutta. Tutkielman kokeellinen osa suoritettiin VTT Biotekniikan Homeiden molekyylibiologia- ja Entsyymitekniikka-tutkimusryhmiss{\"a} Markku Saloheimon ja Kristiina Kruusin ohjauksessa. Kokeellisessa osassa kerrotaan ensin kahden ekspressiokonstruktin tuotosta Trichoderma reeseiss{\"a} sek{\"a} konstruktien analysoinnista immunoblottauksen avulla. Toisessa konstruktissa oli pelkk{\"a} M. albomyces -lakkaasin (MaL) cDNA, ja toisessa MaL:n cDNA fuusioituna hfpl-geenin kanssa. Tutkimuksessa havaittiin, ett{\"a} HFB1-lakkaasi-fuusioproteiini pilkkoutuu jo solun sis{\"a}ll{\"a}, eik{\"a} intaktia fuusioproteiinia n{\"a}ytt{\"a}nyt erittyv{\"a}n kasvuliuokseen. Tutkimuksen toisessa osassa kerrotaan nelj{\"a}n erilaisen C-terminaalisen lakkaasimutantin DNA-konstruktien valmistuksesta, niiden transformoinnista Trichoderma reeseihin, mutanttiproteiinien tuotosta, puhdistuksesta sek{\"a} aktiivisuusm{\"a}{\"a}rityksist{\"a}. Tutkimuksessa k{\"a}vi ilmi, ett{\"a} kolmella lakkaasimutantilla (M1, M2 ja M4) oli selv{\"a} vaikutus proteiinin tuottoon T. reeseiss{\"a}. M1- ja M2-lakkaasimutantit olivat my{\"o}s osittain hajonneina kasvuliuoksessa, joka viittaisi siihen, etta lakkaasimutantit ovat villityypin lakkaasia herkempi{\"a} T. reesein tuottamille proteaaseille. Lis{\"a}ksi k{\"a}vi ilmi, ett{\"a} M1-, M2- ja M4-lakkaasimutanttien katalyyttinen aktiivisuus oli selv{\"a}sti villityypin lakkaasia matalampaa. M3-mutaatiolla ei ollut selv{\"a}{\"a} vaikutusta lakkaasin tuottoon eik{\"a} sen katalyyttiseen aktiivisuuteen. M3-mutaatio n{\"a}ytti kuitenkin muuttavan lakkaasin prosessointia, sill{\"a} C-terminaalisen sekvensoinnin tuloksista voitiin p{\"a}{\"a}tell{\"a}, ett{\"a} SDS-PAGE geelill{\"a} puhtaalta n{\"a}ytt{\"a}nyt n{\"a}yte sis{\"a}lsi monia eri kohdista pilkottuja proteiinipopulaatioita.",
author = "Erkko Yl{\"o}sm{\"a}ki",
note = "CA: BEL pro gradu Helsingin yliopisto, Bio- ja ymp{\"a}rist{\"o}tieteiden laitos, Perinn{\"o}llisyystiede",
year = "2005",
language = "Finnish",
publisher = "University of Helsinki",
address = "Finland",
school = "University of Helsinki",

}

Ylösmäki, E 2005, 'Melanocarpus albomyces –lakkaasin C-terminuksen mutagenisointi: Pro gradu', Master Degree, University of Helsinki, Helsinki.

Melanocarpus albomyces –lakkaasin C-terminuksen mutagenisointi : Pro gradu. / Ylösmäki, Erkko.

Helsinki : University of Helsinki, 2005. 64 p.

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

TY - THES

T1 - Melanocarpus albomyces –lakkaasin C-terminuksen mutagenisointi

T2 - Pro gradu

AU - Ylösmäki, Erkko

N1 - CA: BEL pro gradu Helsingin yliopisto, Bio- ja ympäristötieteiden laitos, Perinnöllisyystiede

PY - 2005

Y1 - 2005

N2 - Tutkielman kirjallisessa osassa tarkastellaan ensin tunnetuimpia sini-kuparioksidaaseja yleisellä tasolla, jonka jälkeen tarkastellaan lakkaaseja, niiden evoluutiota, toimintaa ja levinneisyyttä hieman lähemmin. Tämän jälkeen keskitytään sienten lakkaasien ominaisuuksien, geenisekvenssien, kiderakenteiden seka toimintamekanismin tarkasteluun. Melanocarpus albomyces -lakkaasin ominaisuuksia, lakkaasigeeniä, ja sen kloonausta seka M. albomyces -lakkaasin rakennetta tarkastellaan yksityiskohtaisesti. Lopuksi käydään läpi lakkaasien heterologiseen tuottoon sekä lakkaasien mahdollisiin teollisiin sovelluksiin liittyvää kirjallisuutta. Tutkielman kokeellinen osa suoritettiin VTT Biotekniikan Homeiden molekyylibiologia- ja Entsyymitekniikka-tutkimusryhmissä Markku Saloheimon ja Kristiina Kruusin ohjauksessa. Kokeellisessa osassa kerrotaan ensin kahden ekspressiokonstruktin tuotosta Trichoderma reeseissä sekä konstruktien analysoinnista immunoblottauksen avulla. Toisessa konstruktissa oli pelkkä M. albomyces -lakkaasin (MaL) cDNA, ja toisessa MaL:n cDNA fuusioituna hfpl-geenin kanssa. Tutkimuksessa havaittiin, että HFB1-lakkaasi-fuusioproteiini pilkkoutuu jo solun sisällä, eikä intaktia fuusioproteiinia näyttänyt erittyvän kasvuliuokseen. Tutkimuksen toisessa osassa kerrotaan neljän erilaisen C-terminaalisen lakkaasimutantin DNA-konstruktien valmistuksesta, niiden transformoinnista Trichoderma reeseihin, mutanttiproteiinien tuotosta, puhdistuksesta sekä aktiivisuusmäärityksistä. Tutkimuksessa kävi ilmi, että kolmella lakkaasimutantilla (M1, M2 ja M4) oli selvä vaikutus proteiinin tuottoon T. reeseissä. M1- ja M2-lakkaasimutantit olivat myös osittain hajonneina kasvuliuoksessa, joka viittaisi siihen, etta lakkaasimutantit ovat villityypin lakkaasia herkempiä T. reesein tuottamille proteaaseille. Lisäksi kävi ilmi, että M1-, M2- ja M4-lakkaasimutanttien katalyyttinen aktiivisuus oli selvästi villityypin lakkaasia matalampaa. M3-mutaatiolla ei ollut selvää vaikutusta lakkaasin tuottoon eikä sen katalyyttiseen aktiivisuuteen. M3-mutaatio näytti kuitenkin muuttavan lakkaasin prosessointia, sillä C-terminaalisen sekvensoinnin tuloksista voitiin päätellä, että SDS-PAGE geelillä puhtaalta näyttänyt näyte sisälsi monia eri kohdista pilkottuja proteiinipopulaatioita.

AB - Tutkielman kirjallisessa osassa tarkastellaan ensin tunnetuimpia sini-kuparioksidaaseja yleisellä tasolla, jonka jälkeen tarkastellaan lakkaaseja, niiden evoluutiota, toimintaa ja levinneisyyttä hieman lähemmin. Tämän jälkeen keskitytään sienten lakkaasien ominaisuuksien, geenisekvenssien, kiderakenteiden seka toimintamekanismin tarkasteluun. Melanocarpus albomyces -lakkaasin ominaisuuksia, lakkaasigeeniä, ja sen kloonausta seka M. albomyces -lakkaasin rakennetta tarkastellaan yksityiskohtaisesti. Lopuksi käydään läpi lakkaasien heterologiseen tuottoon sekä lakkaasien mahdollisiin teollisiin sovelluksiin liittyvää kirjallisuutta. Tutkielman kokeellinen osa suoritettiin VTT Biotekniikan Homeiden molekyylibiologia- ja Entsyymitekniikka-tutkimusryhmissä Markku Saloheimon ja Kristiina Kruusin ohjauksessa. Kokeellisessa osassa kerrotaan ensin kahden ekspressiokonstruktin tuotosta Trichoderma reeseissä sekä konstruktien analysoinnista immunoblottauksen avulla. Toisessa konstruktissa oli pelkkä M. albomyces -lakkaasin (MaL) cDNA, ja toisessa MaL:n cDNA fuusioituna hfpl-geenin kanssa. Tutkimuksessa havaittiin, että HFB1-lakkaasi-fuusioproteiini pilkkoutuu jo solun sisällä, eikä intaktia fuusioproteiinia näyttänyt erittyvän kasvuliuokseen. Tutkimuksen toisessa osassa kerrotaan neljän erilaisen C-terminaalisen lakkaasimutantin DNA-konstruktien valmistuksesta, niiden transformoinnista Trichoderma reeseihin, mutanttiproteiinien tuotosta, puhdistuksesta sekä aktiivisuusmäärityksistä. Tutkimuksessa kävi ilmi, että kolmella lakkaasimutantilla (M1, M2 ja M4) oli selvä vaikutus proteiinin tuottoon T. reeseissä. M1- ja M2-lakkaasimutantit olivat myös osittain hajonneina kasvuliuoksessa, joka viittaisi siihen, etta lakkaasimutantit ovat villityypin lakkaasia herkempiä T. reesein tuottamille proteaaseille. Lisäksi kävi ilmi, että M1-, M2- ja M4-lakkaasimutanttien katalyyttinen aktiivisuus oli selvästi villityypin lakkaasia matalampaa. M3-mutaatiolla ei ollut selvää vaikutusta lakkaasin tuottoon eikä sen katalyyttiseen aktiivisuuteen. M3-mutaatio näytti kuitenkin muuttavan lakkaasin prosessointia, sillä C-terminaalisen sekvensoinnin tuloksista voitiin päätellä, että SDS-PAGE geelillä puhtaalta näyttänyt näyte sisälsi monia eri kohdista pilkottuja proteiinipopulaatioita.

M3 - Master's thesis

PB - University of Helsinki

CY - Helsinki

ER -

Ylösmäki E. Melanocarpus albomyces –lakkaasin C-terminuksen mutagenisointi: Pro gradu. Helsinki: University of Helsinki, 2005. 64 p.