Saccharomyces cerevisiae -leivinhiivan transketolaasien rooli ksyloosifermentaatiossa: Pro gradu

Etanolin tuotto lignoselluloosasta on taloudellisesti kannattavaa vasta, jos sekä heksoosi- että pentoosisokerit saadaan fermentoitua. Leivinhiivasta (Saccharomyces cerevisiae) on saatu rakennettua ksyloosia käyttäviä kantoja, mutta etanolin tuotto ei ole ollut riittävän tehokasta. Yhdeksi rajoittavaksi tekijäksi on epäilty riittämätöntä hapettamattoman pentoosifosfaattireitin aktiivisuutta. Siirsin työssäni leivinhiivan omia transketolaasi-isoentsyymejä 1 ja 2 (Tkl1p, Tkl2p) koodaavat geenit (TKL1, TKL2) ylituottoplasmideissa kahteen erilaiseen ksyloosia fermentoivaan leivinhiivakantaan. Molemmilla kannoilla oli Pichia stipitis -hiivasta kloonatut geenit XYL1 ja XYL2 (ksyloosireduktaasin ja ksylitolidehydrogenaasin geenit, vastaavasti) genomissaan. Toisella kannalla oli genomiin integroituna ja ylituotettuna lisäksi leivinhiivan oma XKS1 (ksylulokinaasin geeni). Kun toiseenkin siirrettiin XKS1 ylituottoplasmidissa, ksylulokinaasin eri määrien vaikutusta saatiin verrattua transketolaasien ylituoton rinnalla. Lisäksi tein ksyloosia fermentoivasta hiivasta (XYL1 ja XYL2 integroituna, XKS1 plasmidissa) transketolaasien suhteen poistogeeniset kannat, joissa ylituotin jäljelle jäänyttä transketolaasia monikopioplasmidissa. Näillä kannoilla haluttiin selvittää, oliko etanolin tuoton kannalta edullista, että ksyloosilla kasvava kanta tuottaa vain toista transketolaasia. Aikaansaatuja kantoja kasvatettiin ksyloosilla aerobisesti ja joitakin myös anaerobisesti. Korkean erottelukyvyn nestekromatografian avulla seurattiin etanolin ja muiden aineiden muodostumista. Havaittiin, että kummankaan transketolaasin poistolla tai ylituotolla ei ollut merkittävää vaikutusta etanolin saantoon. Tkl1p:n ylituotto matalamman ksylulokinaasin (XK) ylituoton kanssa vähensi ksylitolin muodostumista aerobisissa viljelmissä. Voimakkaamman XK:n ylituoton kanssa se useimmiten heikensi biomassan tuottoa ja XK:n ylituoton voimakkuudesta riippumatta kasvuliuokseen kertyi tuntematonta ja todennäköisesti kasvua häiritsevää ainetta korkeilla solumääriIIä. Tkl2p:n ylituotto puolestaan joko vähensi tuntemattoman aineen kertymistä tai sillä ei ollut vaikutusta. Se paransi biomassan tuottoa, kun XK oli voimakkaammin ylituotettuna. Poistogeenisillä kannoilla huomattiin, että ksyloosia fermentoivalla hiivalla Tkl2p on välttämätön ksyloosilla kasvuun, mitä Tkl1p ei ollut, jos Tkl2p:tä ylituotettiin. Työn toinen tavoite oli selvittää vielä melko tuntemattoman Tkl2p:n entsyymiaktiivisuutta. Kumpaakin transketolaasia puhdistettiin ja aktiivisuuksia etsittiin eri aineita käyttämällä. Dihydroksiasetonisyntaasin (DHAS) tiedetään käyttävän tunnettujen transketolaasien substraattien lisäksi asetaldehydiä ja formaldehydiä ja haluttiin tarkistaa, onko Tkl2p:llä vastaavia aktiivisuuksia. Tkl2p:llä saatiin mitattua selkeä aktiivisuus erytroosi-4-fosfaatin, riboosi-5-fosfaatin, glykoaldehydin ja glyseraldehydin kanssa, kun toisena aineena oli ksyluloosi-5-fosfaatti. Myös ksyluloosi-5-fosfaatilla yksinään näytti tapahtuvan reaktio. Mitään erityistä omaa substraattia Tkl2p:lle ei löytynyt, eikä se entsyymiaktiivisuuksien perusteella ole DHAS. Sen sijaan Tkl1p näytti yllättäen käyttävän asetaldehydiä yhdessä ksyluloosi-5-fosfaatin kanssa ja lisäksi pyruvaatti oli toistuvasti niiden aineiden joukossa, jotka saattavat olla Tkl1p:n substraatteja.