Lehmän pötsistä hiilimonoksidi- ja hiilidioksidirikastuksen kautta eristettyjen bakteerien fenotyyppinen sekä molekyylibiologinen karakterisointi: Pro gradu

Vera-Maria Martomaa

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

Abstract

Gradutyö suoritettiin VTT Biotekniikan Gasferm-projektissa. Projekti oli Tekniikan kehittämiskeskuksen (Tekes) ja yksityisen yrityksen rahoittama projekti, jonka tavoitteena oli luoda pohjaa lignoselluloosan biokonversiolle etanoliksi. Gradutyön päätavoite oli hiilimonoksidia ja/tai dioksidia hiilenlähteenään käyttävien bakteerien eristäminen lehmän pötsistä. Työn alatavoitteina oli eristettyjen bakteerien ominaisuuksien sekä kaasumaisten substraattien käyttökyvyn tutkiminen. Lisäksi työssä tutkittiin mikrobipopulaation muutosta rikastusprosessin aikana. Kirjallisuusosiossa kartoitettiin bakteerien hiilimonoksidin ja hiilidioksidin käyttöä ja niiden kiertoa maapallolla. Osiossa kuvattiin perustiedot asetogeenisistä bakteereista ja niiden ekologiasta. Pötsin toimintaa sekä pötsimikrobiston koostumusta selvitettiin vertaillen tutkimuksia, joista on eristetty ja kuvattu märehtijöiden pötsistä asetogeenisiä bakteereja. Lisäksi käsiteltiin työn kannalta oleellisia mikrobiston karakterisointimenetelmiä. Kokeellisessa osassa eristettiin lehmän pötsinesteestä isolaatteja hiilimonoksidi- ja hiilidioksidirikastusviljelmän kautta. Eristetyt isolaatit ryhmiteltiin hapensietotestin sekä RAPD-PCR:n sormenjälkikuvioiden perusteella. Jatkokarakterisointiin valitut kannat tunnistettiin käyttäen fenotyyppisiä ja molekyylibiologisia (ribotyypitys ja 16S rRNA geenin sekvensointi) menetelmiä. Yhden kannan kykyä kasvaa hiilimonoksidi ja hiilidioksidi ainoana hiilenlähteenään tutkittiin kasvattamalla sitä anaerobisesti minimialustalla muunnetussa kaasuatmosfäärissä. Populaatiomuutoksia rikastusviljelyn aikana tutkittiin PCR-DGGE:n avulla. Pötsinesteestä eristettiin yhteensä 170 bakteeri-isolaattia, joista hapensietotestin perusteella 24 kasvoi paremmin anaerobisesti kuin aerobisesti. RAPD-PCR:n sormenjälkikuvioiden perusteella nämä 24 isolaattia kuuluivat kolmeen eri sormenjälkityyppiin. Näistä kolmesta RAPD-tyypistä jatkokarakterisoitiin kolme kantaa. Ribotyypityksellä ja API 20Strep-identifiointiliuskoilla kannoille ei saatu luotettavaa lajitunnistusta. 16S rRNA:n geenin sekvensoinnin perusteella kannat osoittautuivat Streptococcus bovis-, Streptococcus ferus- ja Streptococcus macedonicus -lajien kannoiksi. S. bovis -kanta valittiin kaasujen käyttökokeeseen. Kanta ei kokeen perusteella käyttänyt hiilimonoksidia tai hiilidioksidia hiilenlähteenään. Rikastusviljelmissä havaittiin PCR-DGGE -menetelmällä monimuotoinen sormenjälki koko rikastuksen ajan. Streptokokit ovat yleisiä pötsistä eristettyjä bakteereja, joilla ei ole todettu olevan asetyylikoentsyymi-A-reittiä. Niiden ei ole myöskään todettu käyttävän kaasumaisia substraatteja hiilenlähteinään. Käytetty rikastusmenetelmä valikoi luultavasti nopeasti kasvavia ja niukkaravinteiseen alustaan tyytyviä bakteereja. Lisäksi eristysvaihe saattoi valikoida streptokokkeja. PCR-DGGE analyysissä havaittu bakteeripopulaation monimuotoisuus viittaa siihen, ettei eristysvaiheessa saatu riittävän hyvin erotettua mahdollisesti pienempinä pitoisuuksina esiintyneitä bakteerilajeja.
Original languageFinnish
QualificationMaster Degree
Awarding Institution
  • University of Helsinki
Place of PublicationHelsinki
Publisher
Publication statusPublished - 2004
MoE publication typeG2 Master's thesis, polytechnic Master's thesis

Keywords

  • RAPD
  • PCR-DGGE

Cite this