Molekyylibiologisten menetelmien kehittäminen ihmisen suoliston sulfaattia pelkistävien bakteerien määrittämiseksi

Pro gradu

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

Abstract

Ihmisen ruuansulatuskanavan bakteeriston kehitys alkaa syntymästä, jolloin ensimmäiset bakteerit kansoittavat steriilin ruuansulatuskanavan. Bakteeristo kehittyy perimän, ympäristön ja varhaisen ruokavalion vaikutuksesta kohti monimuotoisempaa bakteeripopulaatiota. Aikuisen ruuansulatuskanavan normaalibakteeristo on varsin muuttumaton, mutta siihen vaikuttavat monet tekijät, kuten ikä, terveydentila, ruokavalio ja antibioottien käyttö. Bakteeriston koostumus vaihtelee ruuansulatuskanavan eri osissa ja bakteerimäärä kasvaa kohti paksusuolta, ollen paksusuolessa ja ulosteessa peräti 1010-1012 pmy/ml. Suurin osa ruuansulatuskanavan bakteereista on anaerobeja. Ruuansulatuskanavan bakteeristo vaikuttaa muun muassa suoliston kehittymiseen ja hiilihydraattien ja proteiinien hajotukseen sekä toimii osana immuunipuolustusta. Sulfaattia pelkistävät bakteerit (SRB) ovat monimuotoinen ryhmä pääosin anaerobisia bakteereita, jotka käyttävät aineenvaihdunnassaan elektronin vastaanottajana sulfaattia muuttaen sen lopulta sulfidiksi. SRB:t ovat sopeutuneet useisiin erilaisiin ympäristöihin. Niitä tavataan mm. vesistöjen sedimenteissä sekä ihmisen ruuansulatuskanavassa. Ihmisen ruuansulatuskanavassa on SRB:ta n. 105-108 pmy/g, ja niitä on löydetty erityisesti anaerobisista osista kuten suun ientaskuista ja paksusuolesta. SRB:t voivat olla haitaksi ruuansulatuskanavalle tuottamansa sulfidin vuoksi, joka esiintyy vesiliuoksessa vetysulfidina. Tämän on havaittu olevan toksista suoliston epiteelisoluille. Viimeaikoina on kiinnostuttu sulfaatinpelkistäjien yhteydestä suoliston sairaustiloihin, kuten tulehduksellisiin suolistosairauksiin (IBD). Pro gradu -tutkimukseni tavoitteena oli kehittää PCR-DGGE- ja qPCR-menetelmät ulosteen sulfaattia pelkistävien bakteerien määritykseen. Kohdegeeninä menetelmänkehityksessä käytettiin dsrAB-geeniä, joka koodaa dissimilatorista sulfiitinpelkistysentsyymiä. dsrAB-geeni on sulfaatinpelkistäjille ominainen konservoitunut geenialue, johon perustuvia tutkimuksia ei vielä ole paljon ihmispuolelta. qPCR-menetelmä saatiin optimoitua herkäksi ja spesifiseksi käyttäen dsrA-geenispesifisiä alukkeita, mutta PCR-DGGE-menetelmää ei saatu optimoitua käytössä olleilla alukkeilla, jotka monistivat PCR-DGGE:ssa myös negatiivikontrollikantoja. Tutkittaessa qPCR:lla IBD:tä (Crohn ja ulseratiivinen koliitti) sairastavien lasten ja terveiden kontrollihenkilöiden ulostenäytteistä eristettyä DNA:ta, merkittävää eroa SRB-määrissä ei havaittu eri ryhmien välillä. Crohnin tautia sairastavien aktiivisen vaiheen ja oireettoman vaiheen näytteiden välillä oli kuitenkin tilastollisesti merkitsevä ero (SRB-määrät; oireeton vaihe>oireellinen vaihe) (P <0,05).
Original languageFinnish
QualificationMaster Degree
Awarding Institution
  • University of Helsinki
Place of PublicationHelsinki
Publisher
Publication statusPublished - 2011
MoE publication typeG2 Master's thesis, polytechnic Master's thesis

Keywords

  • dsrAB-geeni
  • IBD
  • ihmisen suolistobakteeristo
  • PCR-DGGE
  • qPCR
  • sulfaattia pelkistävät bakteerit (SRB)
  • dsrAB-gene
  • human faecal microbiota
  • sulphate-reducing bacteria (SRB)

Cite this

@phdthesis{ef2eaf315edb49428dc56530a0669e1a,
title = "Molekyylibiologisten menetelmien kehitt{\"a}minen ihmisen suoliston sulfaattia pelkist{\"a}vien bakteerien m{\"a}{\"a}ritt{\"a}miseksi: Pro gradu",
abstract = "Ihmisen ruuansulatuskanavan bakteeriston kehitys alkaa syntym{\"a}st{\"a}, jolloin ensimm{\"a}iset bakteerit kansoittavat steriilin ruuansulatuskanavan. Bakteeristo kehittyy perim{\"a}n, ymp{\"a}rist{\"o}n ja varhaisen ruokavalion vaikutuksesta kohti monimuotoisempaa bakteeripopulaatiota. Aikuisen ruuansulatuskanavan normaalibakteeristo on varsin muuttumaton, mutta siihen vaikuttavat monet tekij{\"a}t, kuten ik{\"a}, terveydentila, ruokavalio ja antibioottien k{\"a}ytt{\"o}. Bakteeriston koostumus vaihtelee ruuansulatuskanavan eri osissa ja bakteerim{\"a}{\"a}r{\"a} kasvaa kohti paksusuolta, ollen paksusuolessa ja ulosteessa per{\"a}ti 1010-1012 pmy/ml. Suurin osa ruuansulatuskanavan bakteereista on anaerobeja. Ruuansulatuskanavan bakteeristo vaikuttaa muun muassa suoliston kehittymiseen ja hiilihydraattien ja proteiinien hajotukseen sek{\"a} toimii osana immuunipuolustusta. Sulfaattia pelkist{\"a}v{\"a}t bakteerit (SRB) ovat monimuotoinen ryhm{\"a} p{\"a}{\"a}osin anaerobisia bakteereita, jotka k{\"a}ytt{\"a}v{\"a}t aineenvaihdunnassaan elektronin vastaanottajana sulfaattia muuttaen sen lopulta sulfidiksi. SRB:t ovat sopeutuneet useisiin erilaisiin ymp{\"a}rist{\"o}ihin. Niit{\"a} tavataan mm. vesist{\"o}jen sedimenteiss{\"a} sek{\"a} ihmisen ruuansulatuskanavassa. Ihmisen ruuansulatuskanavassa on SRB:ta n. 105-108 pmy/g, ja niit{\"a} on l{\"o}ydetty erityisesti anaerobisista osista kuten suun ientaskuista ja paksusuolesta. SRB:t voivat olla haitaksi ruuansulatuskanavalle tuottamansa sulfidin vuoksi, joka esiintyy vesiliuoksessa vetysulfidina. T{\"a}m{\"a}n on havaittu olevan toksista suoliston epiteelisoluille. Viimeaikoina on kiinnostuttu sulfaatinpelkist{\"a}jien yhteydest{\"a} suoliston sairaustiloihin, kuten tulehduksellisiin suolistosairauksiin (IBD). Pro gradu -tutkimukseni tavoitteena oli kehitt{\"a}{\"a} PCR-DGGE- ja qPCR-menetelm{\"a}t ulosteen sulfaattia pelkist{\"a}vien bakteerien m{\"a}{\"a}ritykseen. Kohdegeenin{\"a} menetelm{\"a}nkehityksess{\"a} k{\"a}ytettiin dsrAB-geeni{\"a}, joka koodaa dissimilatorista sulfiitinpelkistysentsyymi{\"a}. dsrAB-geeni on sulfaatinpelkist{\"a}jille ominainen konservoitunut geenialue, johon perustuvia tutkimuksia ei viel{\"a} ole paljon ihmispuolelta. qPCR-menetelm{\"a} saatiin optimoitua herk{\"a}ksi ja spesifiseksi k{\"a}ytt{\"a}en dsrA-geenispesifisi{\"a} alukkeita, mutta PCR-DGGE-menetelm{\"a}{\"a} ei saatu optimoitua k{\"a}yt{\"o}ss{\"a} olleilla alukkeilla, jotka monistivat PCR-DGGE:ssa my{\"o}s negatiivikontrollikantoja. Tutkittaessa qPCR:lla IBD:t{\"a} (Crohn ja ulseratiivinen koliitti) sairastavien lasten ja terveiden kontrollihenkil{\"o}iden ulosten{\"a}ytteist{\"a} eristetty{\"a} DNA:ta, merkitt{\"a}v{\"a}{\"a} eroa SRB-m{\"a}{\"a}riss{\"a} ei havaittu eri ryhmien v{\"a}lill{\"a}. Crohnin tautia sairastavien aktiivisen vaiheen ja oireettoman vaiheen n{\"a}ytteiden v{\"a}lill{\"a} oli kuitenkin tilastollisesti merkitsev{\"a} ero (SRB-m{\"a}{\"a}r{\"a}t; oireeton vaihe>oireellinen vaihe) (P <0,05).",
keywords = "dsrAB-geeni, IBD, ihmisen suolistobakteeristo, PCR-DGGE, qPCR, sulfaattia pelkist{\"a}v{\"a}t bakteerit (SRB), dsrAB-gene, human faecal microbiota, sulphate-reducing bacteria (SRB)",
author = "Tiina Hyyti{\"a}inen",
note = "HUO: NT Food solutions CA2: TK401 OH: Pro gradu PGN: 74 s.",
year = "2011",
language = "Finnish",
publisher = "University of Helsinki",
address = "Finland",
school = "University of Helsinki",

}

Molekyylibiologisten menetelmien kehittäminen ihmisen suoliston sulfaattia pelkistävien bakteerien määrittämiseksi : Pro gradu. / Hyytiäinen, Tiina.

Helsinki : University of Helsinki, 2011. 74 p.

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

TY - THES

T1 - Molekyylibiologisten menetelmien kehittäminen ihmisen suoliston sulfaattia pelkistävien bakteerien määrittämiseksi

T2 - Pro gradu

AU - Hyytiäinen, Tiina

N1 - HUO: NT Food solutions CA2: TK401 OH: Pro gradu PGN: 74 s.

PY - 2011

Y1 - 2011

N2 - Ihmisen ruuansulatuskanavan bakteeriston kehitys alkaa syntymästä, jolloin ensimmäiset bakteerit kansoittavat steriilin ruuansulatuskanavan. Bakteeristo kehittyy perimän, ympäristön ja varhaisen ruokavalion vaikutuksesta kohti monimuotoisempaa bakteeripopulaatiota. Aikuisen ruuansulatuskanavan normaalibakteeristo on varsin muuttumaton, mutta siihen vaikuttavat monet tekijät, kuten ikä, terveydentila, ruokavalio ja antibioottien käyttö. Bakteeriston koostumus vaihtelee ruuansulatuskanavan eri osissa ja bakteerimäärä kasvaa kohti paksusuolta, ollen paksusuolessa ja ulosteessa peräti 1010-1012 pmy/ml. Suurin osa ruuansulatuskanavan bakteereista on anaerobeja. Ruuansulatuskanavan bakteeristo vaikuttaa muun muassa suoliston kehittymiseen ja hiilihydraattien ja proteiinien hajotukseen sekä toimii osana immuunipuolustusta. Sulfaattia pelkistävät bakteerit (SRB) ovat monimuotoinen ryhmä pääosin anaerobisia bakteereita, jotka käyttävät aineenvaihdunnassaan elektronin vastaanottajana sulfaattia muuttaen sen lopulta sulfidiksi. SRB:t ovat sopeutuneet useisiin erilaisiin ympäristöihin. Niitä tavataan mm. vesistöjen sedimenteissä sekä ihmisen ruuansulatuskanavassa. Ihmisen ruuansulatuskanavassa on SRB:ta n. 105-108 pmy/g, ja niitä on löydetty erityisesti anaerobisista osista kuten suun ientaskuista ja paksusuolesta. SRB:t voivat olla haitaksi ruuansulatuskanavalle tuottamansa sulfidin vuoksi, joka esiintyy vesiliuoksessa vetysulfidina. Tämän on havaittu olevan toksista suoliston epiteelisoluille. Viimeaikoina on kiinnostuttu sulfaatinpelkistäjien yhteydestä suoliston sairaustiloihin, kuten tulehduksellisiin suolistosairauksiin (IBD). Pro gradu -tutkimukseni tavoitteena oli kehittää PCR-DGGE- ja qPCR-menetelmät ulosteen sulfaattia pelkistävien bakteerien määritykseen. Kohdegeeninä menetelmänkehityksessä käytettiin dsrAB-geeniä, joka koodaa dissimilatorista sulfiitinpelkistysentsyymiä. dsrAB-geeni on sulfaatinpelkistäjille ominainen konservoitunut geenialue, johon perustuvia tutkimuksia ei vielä ole paljon ihmispuolelta. qPCR-menetelmä saatiin optimoitua herkäksi ja spesifiseksi käyttäen dsrA-geenispesifisiä alukkeita, mutta PCR-DGGE-menetelmää ei saatu optimoitua käytössä olleilla alukkeilla, jotka monistivat PCR-DGGE:ssa myös negatiivikontrollikantoja. Tutkittaessa qPCR:lla IBD:tä (Crohn ja ulseratiivinen koliitti) sairastavien lasten ja terveiden kontrollihenkilöiden ulostenäytteistä eristettyä DNA:ta, merkittävää eroa SRB-määrissä ei havaittu eri ryhmien välillä. Crohnin tautia sairastavien aktiivisen vaiheen ja oireettoman vaiheen näytteiden välillä oli kuitenkin tilastollisesti merkitsevä ero (SRB-määrät; oireeton vaihe>oireellinen vaihe) (P <0,05).

AB - Ihmisen ruuansulatuskanavan bakteeriston kehitys alkaa syntymästä, jolloin ensimmäiset bakteerit kansoittavat steriilin ruuansulatuskanavan. Bakteeristo kehittyy perimän, ympäristön ja varhaisen ruokavalion vaikutuksesta kohti monimuotoisempaa bakteeripopulaatiota. Aikuisen ruuansulatuskanavan normaalibakteeristo on varsin muuttumaton, mutta siihen vaikuttavat monet tekijät, kuten ikä, terveydentila, ruokavalio ja antibioottien käyttö. Bakteeriston koostumus vaihtelee ruuansulatuskanavan eri osissa ja bakteerimäärä kasvaa kohti paksusuolta, ollen paksusuolessa ja ulosteessa peräti 1010-1012 pmy/ml. Suurin osa ruuansulatuskanavan bakteereista on anaerobeja. Ruuansulatuskanavan bakteeristo vaikuttaa muun muassa suoliston kehittymiseen ja hiilihydraattien ja proteiinien hajotukseen sekä toimii osana immuunipuolustusta. Sulfaattia pelkistävät bakteerit (SRB) ovat monimuotoinen ryhmä pääosin anaerobisia bakteereita, jotka käyttävät aineenvaihdunnassaan elektronin vastaanottajana sulfaattia muuttaen sen lopulta sulfidiksi. SRB:t ovat sopeutuneet useisiin erilaisiin ympäristöihin. Niitä tavataan mm. vesistöjen sedimenteissä sekä ihmisen ruuansulatuskanavassa. Ihmisen ruuansulatuskanavassa on SRB:ta n. 105-108 pmy/g, ja niitä on löydetty erityisesti anaerobisista osista kuten suun ientaskuista ja paksusuolesta. SRB:t voivat olla haitaksi ruuansulatuskanavalle tuottamansa sulfidin vuoksi, joka esiintyy vesiliuoksessa vetysulfidina. Tämän on havaittu olevan toksista suoliston epiteelisoluille. Viimeaikoina on kiinnostuttu sulfaatinpelkistäjien yhteydestä suoliston sairaustiloihin, kuten tulehduksellisiin suolistosairauksiin (IBD). Pro gradu -tutkimukseni tavoitteena oli kehittää PCR-DGGE- ja qPCR-menetelmät ulosteen sulfaattia pelkistävien bakteerien määritykseen. Kohdegeeninä menetelmänkehityksessä käytettiin dsrAB-geeniä, joka koodaa dissimilatorista sulfiitinpelkistysentsyymiä. dsrAB-geeni on sulfaatinpelkistäjille ominainen konservoitunut geenialue, johon perustuvia tutkimuksia ei vielä ole paljon ihmispuolelta. qPCR-menetelmä saatiin optimoitua herkäksi ja spesifiseksi käyttäen dsrA-geenispesifisiä alukkeita, mutta PCR-DGGE-menetelmää ei saatu optimoitua käytössä olleilla alukkeilla, jotka monistivat PCR-DGGE:ssa myös negatiivikontrollikantoja. Tutkittaessa qPCR:lla IBD:tä (Crohn ja ulseratiivinen koliitti) sairastavien lasten ja terveiden kontrollihenkilöiden ulostenäytteistä eristettyä DNA:ta, merkittävää eroa SRB-määrissä ei havaittu eri ryhmien välillä. Crohnin tautia sairastavien aktiivisen vaiheen ja oireettoman vaiheen näytteiden välillä oli kuitenkin tilastollisesti merkitsevä ero (SRB-määrät; oireeton vaihe>oireellinen vaihe) (P <0,05).

KW - dsrAB-geeni

KW - IBD

KW - ihmisen suolistobakteeristo

KW - PCR-DGGE

KW - qPCR

KW - sulfaattia pelkistävät bakteerit (SRB)

KW - dsrAB-gene

KW - human faecal microbiota

KW - sulphate-reducing bacteria (SRB)

UR - http://urn.fi/URN:NBN:fi:hulib-201507211832

M3 - Master's thesis

PB - University of Helsinki

CY - Helsinki

ER -