PCR-DGGE-menetelmän soveltuvuus kompostin sienilajiston tarkasteluun: Pro gradu

Gradutyö suoritettiin VTT Ympäristöbiotekniikan ryhmässä. Tutkimus oli osa Tekniikan kehittämiskeskuksen (Tekes) yhteistyössä VTT:n ja yritysten rahoittamaa projektia, jonka tarkoituksena oli kehittää pikamenetelmiä kompostin kypsyyden ja stabiilisuuden mittaamiseksi. Tämän työn tarkoituksena oli saada kattavampi kuvaus sekä kompostin sienilajiston muutoksista prosessin aikana että erilaisten olosuhteiden vaikutuksesta lopputuotteen sienilajistoon. Työn päätavoitteena oli tutkia, voidaanko molekyylibiologisia menetelmiä soveltaa kompostin sienilajiston muutosten havainnointiin. Kirjallisuusosassa keskityttiin työn kannalta oleellisten menetelmien sovellutuksiin ympäristötutkimuksessa. Työssä käsiteltiin kompostointiprosessia ja kompostin sienilajistoa, jotta voitaisiin arvioida, miten prosessiolosuhteiden muutokset vaikuttavat lajistoon. Lisäksi vertailtiin kirjallisuudessa tutkittuja menetelmiä sienibiomassan määrityksestä ja sieniyhteisöjen sormenjälkimenetelmistä. Pääpaino oli sellaisten molekyylibiologisten menetelmien analysoinnissa, jotka huomioivat mahdollisimman hyvin koko sienilajiston muutokset dynaamisen prosessin aikana. Kokeellisessa osassa tarkasteltiin rinnakkain kompostin kypsyysparametrejä, sienibiomassaa ja sienipopulaatioiden muutoksia dynaamisen prosessin funktiona, ja sitä kautta lähestyttiin kompostin prosessointiolosuhteiden vaikutusta sienipopulaatioon. Sienibiomassaa arvioitiin maljaviljelyiden ja ergosterolipitoisuuden perusteella. Työn aikuvaiheessa vertailtiin kolmea sieni-DNA:n eristysmenetelmää, jotta löydettäisiin sopiva menetelmä kompostinäytteiden sieni-DNA:n eristämiseksi. Parhaaksi menetelmäksi osoittautui menetelmä, jossa raaka-DNA puhdistettiin fenoliuutolla ja GeneClean Turbo (QBiogene, Inc.) -kitillä. Työn toisessa vaiheessa oli tarkoituksena selvittää, voitaisiinko PCR-DGGE-menetelmän avulla havaita sekä prosessoinnin aikana tapahtuvia sienilajiston muutoksia etta prosessointiolosuhteiden vaikutusta sienilajistoon. Pilot-kompostorien kypsyys-, lämpötila-, ja pH-analyysien perusteella voitiin todeta, etta eri voimakkuuksilla ilmastetuissa kompostoreissa myös kypsyminen tapahtui eri nopeuksilla. Kymmenen litraa minuutissa ilmastettu komposti (P3) kypsyi nopeammin kuin 0,5 l min-1 ilmastettu kompostori (P2). Sama trendi oli nähtävissä sienten määrässä. Pilot-kompostinäytteitä (P2-P3) vertailtiin myös kompostointilaitoksessa prosessoituihin näytteisiin. Laitosmittakaavan näyt-teet pystyttiin luokittelemaan kypsyysanalyysien perusteella. Aumakompostien sienibiomassat olivat samaa suuruusluokkaa kuin hyvin ilmastetun Pilot-kompostin (P3). 18S rDNA:n sienispesifisestä PCR-DGGE-menetelmä soveltui kompostinäytteiden analysointiin kahdella alukeparilla. Menetelmällä saatiin erotettua toisistaan kompostoinnin eri vaiheiden sienilajistot. Lisäksi saatiin esille erilaisten prosessiolosuhteiden aiheuttamat muutokset lopputuotteen sienilajistossa. Näitä eroja ja muutoksia ei pystytty osoittamaan pelkästään kypsyysanalyysien eikä sienibiomassan perusteella.