Proteiinien erityksen ja translaation välinen yhteys Trichoderma reesei -homeella: Pro gradu

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

Abstract

Trichoderma reesei on rihmamainen lahottajahome, jolla on erittäin suuri kyky erittää proteiineja kasvualustaan. Tätä ominaisuutta on jo kauan hyödynnetty teollisuudessa, missä T. reesein tuottamat eri sellulaasit ja hemisellulaasit ovat muodostaneet merkittävän osan mm. paperiteollisuuden käyttämistä entsyymeistä. Vaikka T. reesei on poikkeuksellisen tehokas omien proteiiniensa tuotossa, vieraiden proteiinien tuottotasot ovat yleensä huomattavasti matalammat. Tästä syystä sen proteiinisynteesi ja eritysreitti ovat edelleen kiinnostava tutkimuskohde. Yleisesti ajatellaan, että proteiinituoton rajoittavin kohta on usein niiden erittyminen kasvualustaan. Etenkin endoplasmakalvostoon (ER) sijoittuva proteiinien laskostuminen ja glykosylaation aloitus on havaittu suhteellisesti hitaiksi tapahtumiksi. Mikäli kyseessä on solulle vieras proteiini, sen laskostuminen ja muokkaus ovat mitä todennäköisimmin vaikeampia ja proteiinia saattaa kertyä johonkin eritysreitin vaiheeseen. Erityksen estyminen ja proteiinien kertyminen ER:ään aiheuttaa soluille stressitilan, jonka aikaansaamaa pelastautumisreaktiota kutsutaan ER-stressivasteeksi (unfolded protein response; UPR). Nisäkkäillä on havaittu, että ER-stressivasteeseen kytkeytyy myös toinen ilmiö; proteiinien translaation pysähtyminen. Näillä ilmiöillä on huomattava taloudellinen merkitys, mikäli vieraiden proteiinien tuotto aiheuttaa soluille samakaltaisen stressitilan. Tämän Pro gradu -tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää Trichoderma reesei -homeen proteiinien erityksen ja translaation välistä yhteyttä stressioloissa. Tutkimuksessa käytettiin yhtä T. reesein tuotto-ominaisuuksiltaan parannettua mutanttikantaa, Rut-C30:tä. ER-stressivaste voidaan indusoida käsittelemällä soluja proteiinien laskostumiseen, erittymiseen tai glykosylaatioon vaikuttavilla aineilla. Tässä tutkimuksessa proteiinien laskostuminen estettiin rikkisiltojen muodostumisen ehkäisevällä yhdisteellä ditiotreitolilla (DTT). DTT-käsittelyn vaikutusta proteiinien tuotantoon ja eritykseen tutkittiin leimaamalla syntyvät proteiinit metabolisesti 35S-metioniinilla. Malliproteiinina käytettiin T. reesein runsaimmin erittyvää proteiinia, sellobiohydrolaasi I:stä (CBHI). Leimatut proteiinit analysoitiin yksi- tai kaksiulotteisella geelielektroforeesilla sekä saostamalla ne trikloorietikkahapon avulla. DTT:n vaikutusta solunsisäisten, erittyvien sekä eritysreitin proteiineja koodaaviin geeneihin tutkittiin analysoimalla niiden lähetti-RNA-määrien muutokset käsittelyn aikana. Tutkimuksen tuloksena havaittiin, että DTT ei vaikuttanut ER:n jälkeiseen proteiinien erittymiseen tai posttranslationaaliseen muokkaukseen, mutta se esti käsittelyn aikana syntetoitujen proteiinien erittymisen ER:stä eteenpäin. Proteiinien kokonaistranslaatiotaso ei alentunut, vaan jopa kohosi, mutta malliproteiinina käytetyn CBHI:n translaatiotason havaittiin madaltuneen. Tämä tulos merkitsi, että T. reeseillä ei ehkä ole eläinsolujen kaltaista yhteyttä proteiinien erityksen ja translaation välillä, vaan että CBHI:n tuotto olisi säädelty spesifisesti. ER-stressivasteen merkkigeenien (pdi1, bip1) transkriptio indusoitui selvästi DTT-käsittelyn aikana, mutta eritysreitin myöhemmässä vaiheessa vaikuttavien geenien (sar1, ypt1) lähetti-RNA:iden määrissä ei havaittu huomattavia muutoksia. Tutkimuksen merkittävin löytö oli erityksen malliproteiinina käytetyn, CBHI:tä koodaavan lähetti-RNA:n määrän voimakas aleneminen DTT-käsittelyn seurauksena. Tämä ilmiö selitti DTT-käsitellyissä soluissa leimauskokeilla havaitun CBHI:n vähäisemmän määrän. CBHI:llä ensimmäisenä löydetyn transkriptionaalisen säätelyn on myöhemmin havaittu koskevan kaikkia tutkittuja erittyviä proteiineja koodaavia geenejä.
Original languageFinnish
QualificationMaster Degree
Awarding Institution
  • University of Helsinki
Place of PublicationHelsinki
Publisher
Publication statusPublished - 2003
MoE publication typeG2 Master's thesis, polytechnic Master's thesis

Keywords

  • ER-stressivaste (UPR)
  • proteiinien eritys
  • translaatio
  • Trichoderma reesei

Cite this

@phdthesis{0702eac3fcf84e29960f4830add9447e,
title = "Proteiinien erityksen ja translaation v{\"a}linen yhteys Trichoderma reesei -homeella: Pro gradu",
abstract = "Trichoderma reesei on rihmamainen lahottajahome, jolla on eritt{\"a}in suuri kyky eritt{\"a}{\"a} proteiineja kasvualustaan. T{\"a}t{\"a} ominaisuutta on jo kauan hy{\"o}dynnetty teollisuudessa, miss{\"a} T. reesein tuottamat eri sellulaasit ja hemisellulaasit ovat muodostaneet merkitt{\"a}v{\"a}n osan mm. paperiteollisuuden k{\"a}ytt{\"a}mist{\"a} entsyymeist{\"a}. Vaikka T. reesei on poikkeuksellisen tehokas omien proteiiniensa tuotossa, vieraiden proteiinien tuottotasot ovat yleens{\"a} huomattavasti matalammat. T{\"a}st{\"a} syyst{\"a} sen proteiinisynteesi ja eritysreitti ovat edelleen kiinnostava tutkimuskohde. Yleisesti ajatellaan, ett{\"a} proteiinituoton rajoittavin kohta on usein niiden erittyminen kasvualustaan. Etenkin endoplasmakalvostoon (ER) sijoittuva proteiinien laskostuminen ja glykosylaation aloitus on havaittu suhteellisesti hitaiksi tapahtumiksi. Mik{\"a}li kyseess{\"a} on solulle vieras proteiini, sen laskostuminen ja muokkaus ovat mit{\"a} todenn{\"a}k{\"o}isimmin vaikeampia ja proteiinia saattaa kerty{\"a} johonkin eritysreitin vaiheeseen. Erityksen estyminen ja proteiinien kertyminen ER:{\"a}{\"a}n aiheuttaa soluille stressitilan, jonka aikaansaamaa pelastautumisreaktiota kutsutaan ER-stressivasteeksi (unfolded protein response; UPR). Nis{\"a}kk{\"a}ill{\"a} on havaittu, ett{\"a} ER-stressivasteeseen kytkeytyy my{\"o}s toinen ilmi{\"o}; proteiinien translaation pys{\"a}htyminen. N{\"a}ill{\"a} ilmi{\"o}ill{\"a} on huomattava taloudellinen merkitys, mik{\"a}li vieraiden proteiinien tuotto aiheuttaa soluille samakaltaisen stressitilan. T{\"a}m{\"a}n Pro gradu -tutkimuksen tarkoituksena oli selvitt{\"a}{\"a} Trichoderma reesei -homeen proteiinien erityksen ja translaation v{\"a}list{\"a} yhteytt{\"a} stressioloissa. Tutkimuksessa k{\"a}ytettiin yht{\"a} T. reesein tuotto-ominaisuuksiltaan parannettua mutanttikantaa, Rut-C30:t{\"a}. ER-stressivaste voidaan indusoida k{\"a}sittelem{\"a}ll{\"a} soluja proteiinien laskostumiseen, erittymiseen tai glykosylaatioon vaikuttavilla aineilla. T{\"a}ss{\"a} tutkimuksessa proteiinien laskostuminen estettiin rikkisiltojen muodostumisen ehk{\"a}isev{\"a}ll{\"a} yhdisteell{\"a} ditiotreitolilla (DTT). DTT-k{\"a}sittelyn vaikutusta proteiinien tuotantoon ja eritykseen tutkittiin leimaamalla syntyv{\"a}t proteiinit metabolisesti 35S-metioniinilla. Malliproteiinina k{\"a}ytettiin T. reesein runsaimmin erittyv{\"a}{\"a} proteiinia, sellobiohydrolaasi I:st{\"a} (CBHI). Leimatut proteiinit analysoitiin yksi- tai kaksiulotteisella geelielektroforeesilla sek{\"a} saostamalla ne trikloorietikkahapon avulla. DTT:n vaikutusta solunsis{\"a}isten, erittyvien sek{\"a} eritysreitin proteiineja koodaaviin geeneihin tutkittiin analysoimalla niiden l{\"a}hetti-RNA-m{\"a}{\"a}rien muutokset k{\"a}sittelyn aikana. Tutkimuksen tuloksena havaittiin, ett{\"a} DTT ei vaikuttanut ER:n j{\"a}lkeiseen proteiinien erittymiseen tai posttranslationaaliseen muokkaukseen, mutta se esti k{\"a}sittelyn aikana syntetoitujen proteiinien erittymisen ER:st{\"a} eteenp{\"a}in. Proteiinien kokonaistranslaatiotaso ei alentunut, vaan jopa kohosi, mutta malliproteiinina k{\"a}ytetyn CBHI:n translaatiotason havaittiin madaltuneen. T{\"a}m{\"a} tulos merkitsi, ett{\"a} T. reeseill{\"a} ei ehk{\"a} ole el{\"a}insolujen kaltaista yhteytt{\"a} proteiinien erityksen ja translaation v{\"a}lill{\"a}, vaan ett{\"a} CBHI:n tuotto olisi s{\"a}{\"a}delty spesifisesti. ER-stressivasteen merkkigeenien (pdi1, bip1) transkriptio indusoitui selv{\"a}sti DTT-k{\"a}sittelyn aikana, mutta eritysreitin my{\"o}hemm{\"a}ss{\"a} vaiheessa vaikuttavien geenien (sar1, ypt1) l{\"a}hetti-RNA:iden m{\"a}{\"a}riss{\"a} ei havaittu huomattavia muutoksia. Tutkimuksen merkitt{\"a}vin l{\"o}yt{\"o} oli erityksen malliproteiinina k{\"a}ytetyn, CBHI:t{\"a} koodaavan l{\"a}hetti-RNA:n m{\"a}{\"a}r{\"a}n voimakas aleneminen DTT-k{\"a}sittelyn seurauksena. T{\"a}m{\"a} ilmi{\"o} selitti DTT-k{\"a}sitellyiss{\"a} soluissa leimauskokeilla havaitun CBHI:n v{\"a}h{\"a}isemm{\"a}n m{\"a}{\"a}r{\"a}n. CBHI:ll{\"a} ensimm{\"a}isen{\"a} l{\"o}ydetyn transkriptionaalisen s{\"a}{\"a}telyn on my{\"o}hemmin havaittu koskevan kaikkia tutkittuja erittyvi{\"a} proteiineja koodaavia geenej{\"a}.",
keywords = "ER-stressivaste (UPR), proteiinien eritys, translaatio, Trichoderma reesei",
author = "Anne Huuskonen",
note = "CA: BEL pro gradu Helsingin yliopisto, Biotieteiden laitos, Biokemian osasto",
year = "2003",
language = "Finnish",
publisher = "University of Helsinki",
address = "Finland",
school = "University of Helsinki",

}

Proteiinien erityksen ja translaation välinen yhteys Trichoderma reesei -homeella : Pro gradu. / Huuskonen, Anne.

Helsinki : University of Helsinki, 2003. 66 p.

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

TY - THES

T1 - Proteiinien erityksen ja translaation välinen yhteys Trichoderma reesei -homeella

T2 - Pro gradu

AU - Huuskonen, Anne

N1 - CA: BEL pro gradu Helsingin yliopisto, Biotieteiden laitos, Biokemian osasto

PY - 2003

Y1 - 2003

N2 - Trichoderma reesei on rihmamainen lahottajahome, jolla on erittäin suuri kyky erittää proteiineja kasvualustaan. Tätä ominaisuutta on jo kauan hyödynnetty teollisuudessa, missä T. reesein tuottamat eri sellulaasit ja hemisellulaasit ovat muodostaneet merkittävän osan mm. paperiteollisuuden käyttämistä entsyymeistä. Vaikka T. reesei on poikkeuksellisen tehokas omien proteiiniensa tuotossa, vieraiden proteiinien tuottotasot ovat yleensä huomattavasti matalammat. Tästä syystä sen proteiinisynteesi ja eritysreitti ovat edelleen kiinnostava tutkimuskohde. Yleisesti ajatellaan, että proteiinituoton rajoittavin kohta on usein niiden erittyminen kasvualustaan. Etenkin endoplasmakalvostoon (ER) sijoittuva proteiinien laskostuminen ja glykosylaation aloitus on havaittu suhteellisesti hitaiksi tapahtumiksi. Mikäli kyseessä on solulle vieras proteiini, sen laskostuminen ja muokkaus ovat mitä todennäköisimmin vaikeampia ja proteiinia saattaa kertyä johonkin eritysreitin vaiheeseen. Erityksen estyminen ja proteiinien kertyminen ER:ään aiheuttaa soluille stressitilan, jonka aikaansaamaa pelastautumisreaktiota kutsutaan ER-stressivasteeksi (unfolded protein response; UPR). Nisäkkäillä on havaittu, että ER-stressivasteeseen kytkeytyy myös toinen ilmiö; proteiinien translaation pysähtyminen. Näillä ilmiöillä on huomattava taloudellinen merkitys, mikäli vieraiden proteiinien tuotto aiheuttaa soluille samakaltaisen stressitilan. Tämän Pro gradu -tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää Trichoderma reesei -homeen proteiinien erityksen ja translaation välistä yhteyttä stressioloissa. Tutkimuksessa käytettiin yhtä T. reesein tuotto-ominaisuuksiltaan parannettua mutanttikantaa, Rut-C30:tä. ER-stressivaste voidaan indusoida käsittelemällä soluja proteiinien laskostumiseen, erittymiseen tai glykosylaatioon vaikuttavilla aineilla. Tässä tutkimuksessa proteiinien laskostuminen estettiin rikkisiltojen muodostumisen ehkäisevällä yhdisteellä ditiotreitolilla (DTT). DTT-käsittelyn vaikutusta proteiinien tuotantoon ja eritykseen tutkittiin leimaamalla syntyvät proteiinit metabolisesti 35S-metioniinilla. Malliproteiinina käytettiin T. reesein runsaimmin erittyvää proteiinia, sellobiohydrolaasi I:stä (CBHI). Leimatut proteiinit analysoitiin yksi- tai kaksiulotteisella geelielektroforeesilla sekä saostamalla ne trikloorietikkahapon avulla. DTT:n vaikutusta solunsisäisten, erittyvien sekä eritysreitin proteiineja koodaaviin geeneihin tutkittiin analysoimalla niiden lähetti-RNA-määrien muutokset käsittelyn aikana. Tutkimuksen tuloksena havaittiin, että DTT ei vaikuttanut ER:n jälkeiseen proteiinien erittymiseen tai posttranslationaaliseen muokkaukseen, mutta se esti käsittelyn aikana syntetoitujen proteiinien erittymisen ER:stä eteenpäin. Proteiinien kokonaistranslaatiotaso ei alentunut, vaan jopa kohosi, mutta malliproteiinina käytetyn CBHI:n translaatiotason havaittiin madaltuneen. Tämä tulos merkitsi, että T. reeseillä ei ehkä ole eläinsolujen kaltaista yhteyttä proteiinien erityksen ja translaation välillä, vaan että CBHI:n tuotto olisi säädelty spesifisesti. ER-stressivasteen merkkigeenien (pdi1, bip1) transkriptio indusoitui selvästi DTT-käsittelyn aikana, mutta eritysreitin myöhemmässä vaiheessa vaikuttavien geenien (sar1, ypt1) lähetti-RNA:iden määrissä ei havaittu huomattavia muutoksia. Tutkimuksen merkittävin löytö oli erityksen malliproteiinina käytetyn, CBHI:tä koodaavan lähetti-RNA:n määrän voimakas aleneminen DTT-käsittelyn seurauksena. Tämä ilmiö selitti DTT-käsitellyissä soluissa leimauskokeilla havaitun CBHI:n vähäisemmän määrän. CBHI:llä ensimmäisenä löydetyn transkriptionaalisen säätelyn on myöhemmin havaittu koskevan kaikkia tutkittuja erittyviä proteiineja koodaavia geenejä.

AB - Trichoderma reesei on rihmamainen lahottajahome, jolla on erittäin suuri kyky erittää proteiineja kasvualustaan. Tätä ominaisuutta on jo kauan hyödynnetty teollisuudessa, missä T. reesein tuottamat eri sellulaasit ja hemisellulaasit ovat muodostaneet merkittävän osan mm. paperiteollisuuden käyttämistä entsyymeistä. Vaikka T. reesei on poikkeuksellisen tehokas omien proteiiniensa tuotossa, vieraiden proteiinien tuottotasot ovat yleensä huomattavasti matalammat. Tästä syystä sen proteiinisynteesi ja eritysreitti ovat edelleen kiinnostava tutkimuskohde. Yleisesti ajatellaan, että proteiinituoton rajoittavin kohta on usein niiden erittyminen kasvualustaan. Etenkin endoplasmakalvostoon (ER) sijoittuva proteiinien laskostuminen ja glykosylaation aloitus on havaittu suhteellisesti hitaiksi tapahtumiksi. Mikäli kyseessä on solulle vieras proteiini, sen laskostuminen ja muokkaus ovat mitä todennäköisimmin vaikeampia ja proteiinia saattaa kertyä johonkin eritysreitin vaiheeseen. Erityksen estyminen ja proteiinien kertyminen ER:ään aiheuttaa soluille stressitilan, jonka aikaansaamaa pelastautumisreaktiota kutsutaan ER-stressivasteeksi (unfolded protein response; UPR). Nisäkkäillä on havaittu, että ER-stressivasteeseen kytkeytyy myös toinen ilmiö; proteiinien translaation pysähtyminen. Näillä ilmiöillä on huomattava taloudellinen merkitys, mikäli vieraiden proteiinien tuotto aiheuttaa soluille samakaltaisen stressitilan. Tämän Pro gradu -tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää Trichoderma reesei -homeen proteiinien erityksen ja translaation välistä yhteyttä stressioloissa. Tutkimuksessa käytettiin yhtä T. reesein tuotto-ominaisuuksiltaan parannettua mutanttikantaa, Rut-C30:tä. ER-stressivaste voidaan indusoida käsittelemällä soluja proteiinien laskostumiseen, erittymiseen tai glykosylaatioon vaikuttavilla aineilla. Tässä tutkimuksessa proteiinien laskostuminen estettiin rikkisiltojen muodostumisen ehkäisevällä yhdisteellä ditiotreitolilla (DTT). DTT-käsittelyn vaikutusta proteiinien tuotantoon ja eritykseen tutkittiin leimaamalla syntyvät proteiinit metabolisesti 35S-metioniinilla. Malliproteiinina käytettiin T. reesein runsaimmin erittyvää proteiinia, sellobiohydrolaasi I:stä (CBHI). Leimatut proteiinit analysoitiin yksi- tai kaksiulotteisella geelielektroforeesilla sekä saostamalla ne trikloorietikkahapon avulla. DTT:n vaikutusta solunsisäisten, erittyvien sekä eritysreitin proteiineja koodaaviin geeneihin tutkittiin analysoimalla niiden lähetti-RNA-määrien muutokset käsittelyn aikana. Tutkimuksen tuloksena havaittiin, että DTT ei vaikuttanut ER:n jälkeiseen proteiinien erittymiseen tai posttranslationaaliseen muokkaukseen, mutta se esti käsittelyn aikana syntetoitujen proteiinien erittymisen ER:stä eteenpäin. Proteiinien kokonaistranslaatiotaso ei alentunut, vaan jopa kohosi, mutta malliproteiinina käytetyn CBHI:n translaatiotason havaittiin madaltuneen. Tämä tulos merkitsi, että T. reeseillä ei ehkä ole eläinsolujen kaltaista yhteyttä proteiinien erityksen ja translaation välillä, vaan että CBHI:n tuotto olisi säädelty spesifisesti. ER-stressivasteen merkkigeenien (pdi1, bip1) transkriptio indusoitui selvästi DTT-käsittelyn aikana, mutta eritysreitin myöhemmässä vaiheessa vaikuttavien geenien (sar1, ypt1) lähetti-RNA:iden määrissä ei havaittu huomattavia muutoksia. Tutkimuksen merkittävin löytö oli erityksen malliproteiinina käytetyn, CBHI:tä koodaavan lähetti-RNA:n määrän voimakas aleneminen DTT-käsittelyn seurauksena. Tämä ilmiö selitti DTT-käsitellyissä soluissa leimauskokeilla havaitun CBHI:n vähäisemmän määrän. CBHI:llä ensimmäisenä löydetyn transkriptionaalisen säätelyn on myöhemmin havaittu koskevan kaikkia tutkittuja erittyviä proteiineja koodaavia geenejä.

KW - ER-stressivaste (UPR)

KW - proteiinien eritys

KW - translaatio

KW - Trichoderma reesei

M3 - Master's thesis

PB - University of Helsinki

CY - Helsinki

ER -