Proteiinien erityksen ja translaation välinen yhteys Trichoderma reesei -homeella: Pro gradu

Research output: ThesisMaster's thesis

Abstract

Trichoderma reesei on rihmamainen lahottajahome, jolla on erittäin suuri kyky erittää proteiineja kasvualustaan. Tätä ominaisuutta on jo kauan hyödynnetty teollisuudessa, missä T. reesein tuottamat eri sellulaasit ja hemisellulaasit ovat muodostaneet merkittävän osan mm. paperiteollisuuden käyttämistä entsyymeistä. Vaikka T. reesei on poikkeuksellisen tehokas omien proteiiniensa tuotossa, vieraiden proteiinien tuottotasot ovat yleensä huomattavasti matalammat. Tästä syystä sen proteiinisynteesi ja eritysreitti ovat edelleen kiinnostava tutkimuskohde. Yleisesti ajatellaan, että proteiinituoton rajoittavin kohta on usein niiden erittyminen kasvualustaan. Etenkin endoplasmakalvostoon (ER) sijoittuva proteiinien laskostuminen ja glykosylaation aloitus on havaittu suhteellisesti hitaiksi tapahtumiksi. Mikäli kyseessä on solulle vieras proteiini, sen laskostuminen ja muokkaus ovat mitä todennäköisimmin vaikeampia ja proteiinia saattaa kertyä johonkin eritysreitin vaiheeseen. Erityksen estyminen ja proteiinien kertyminen ER:ään aiheuttaa soluille stressitilan, jonka aikaansaamaa pelastautumisreaktiota kutsutaan ER-stressivasteeksi (unfolded protein response; UPR). Nisäkkäillä on havaittu, että ER-stressivasteeseen kytkeytyy myös toinen ilmiö; proteiinien translaation pysähtyminen. Näillä ilmiöillä on huomattava taloudellinen merkitys, mikäli vieraiden proteiinien tuotto aiheuttaa soluille samakaltaisen stressitilan. Tämän Pro gradu -tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää Trichoderma reesei -homeen proteiinien erityksen ja translaation välistä yhteyttä stressioloissa. Tutkimuksessa käytettiin yhtä T. reesein tuotto-ominaisuuksiltaan parannettua mutanttikantaa, Rut-C30:tä. ER-stressivaste voidaan indusoida käsittelemällä soluja proteiinien laskostumiseen, erittymiseen tai glykosylaatioon vaikuttavilla aineilla. Tässä tutkimuksessa proteiinien laskostuminen estettiin rikkisiltojen muodostumisen ehkäisevällä yhdisteellä ditiotreitolilla (DTT). DTT-käsittelyn vaikutusta proteiinien tuotantoon ja eritykseen tutkittiin leimaamalla syntyvät proteiinit metabolisesti 35S-metioniinilla. Malliproteiinina käytettiin T. reesein runsaimmin erittyvää proteiinia, sellobiohydrolaasi I:stä (CBHI). Leimatut proteiinit analysoitiin yksi- tai kaksiulotteisella geelielektroforeesilla sekä saostamalla ne trikloorietikkahapon avulla. DTT:n vaikutusta solunsisäisten, erittyvien sekä eritysreitin proteiineja koodaaviin geeneihin tutkittiin analysoimalla niiden lähetti-RNA-määrien muutokset käsittelyn aikana. Tutkimuksen tuloksena havaittiin, että DTT ei vaikuttanut ER:n jälkeiseen proteiinien erittymiseen tai posttranslationaaliseen muokkaukseen, mutta se esti käsittelyn aikana syntetoitujen proteiinien erittymisen ER:stä eteenpäin. Proteiinien kokonaistranslaatiotaso ei alentunut, vaan jopa kohosi, mutta malliproteiinina käytetyn CBHI:n translaatiotason havaittiin madaltuneen. Tämä tulos merkitsi, että T. reeseillä ei ehkä ole eläinsolujen kaltaista yhteyttä proteiinien erityksen ja translaation välillä, vaan että CBHI:n tuotto olisi säädelty spesifisesti. ER-stressivasteen merkkigeenien (pdi1, bip1) transkriptio indusoitui selvästi DTT-käsittelyn aikana, mutta eritysreitin myöhemmässä vaiheessa vaikuttavien geenien (sar1, ypt1) lähetti-RNA:iden määrissä ei havaittu huomattavia muutoksia. Tutkimuksen merkittävin löytö oli erityksen malliproteiinina käytetyn, CBHI:tä koodaavan lähetti-RNA:n määrän voimakas aleneminen DTT-käsittelyn seurauksena. Tämä ilmiö selitti DTT-käsitellyissä soluissa leimauskokeilla havaitun CBHI:n vähäisemmän määrän. CBHI:llä ensimmäisenä löydetyn transkriptionaalisen säätelyn on myöhemmin havaittu koskevan kaikkia tutkittuja erittyviä proteiineja koodaavia geenejä.
Original languageFinnish
QualificationMaster Degree
Awarding Institution
  • University of Helsinki
Place of PublicationHelsinki
Publisher
Publication statusPublished - 2003
MoE publication typeG2 Master's thesis, polytechnic Master's thesis

Keywords

  • ER-stressivaste (UPR)
  • proteiinien eritys
  • translaatio
  • Trichoderma reesei

Cite this