RT-PCR:n soveltuvuus elävien oluenpilaajabakteerien osoittamiseen: Pro gradu

Tiina Partanen

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

Abstract

Oluessa ja panimoissa elämään sopeutuneita pilaajabakteereita ovat mm. eräät Lactobacillus ja Pediococcus -sukujen maitohappobakteerit, anaerobiset Pectinatus ja Megasphaera -sukujen bakteerit, sekä harvinaisemmat Obesumbacterium proteus ja Zymomonas mobilis. Maitohappobakteerit ovat yleisimpiä olutta pilaavia bakteereita. Lisäksi erilaiset hiivat voivat pilata olutta. Pilaajamikrobit aiheuttavat oluen samentumista ja erilaisia haju- ja makuvirheitä. Mikrobit osoitetaan panimoissa viljelyyn perustuvilla menetelmillä, jotka ovat usein melko hitaita (3-7 vrk). PCR:ään perustuvat menetelmät ovat nopeita ja herkkiä, ja niitä on sovellettu myös panimoiden laadunvalvontaan. Perinteisen PCR:n, jossa osoitetaan DNA:ta, huonona puolena on se, että menetelmän avulla ei kyetä erottamaan eläviä ja kuolleita pilaajabakteereita toisistaan, koska DNA säilyy kuolleissa soluissa stabiilina pitkiä aikoja. RNA on DNA:ta epästabiilimpi molekyyli, joka hajoaa yleensä kuolleesta solusta DNA:ta nopeammin. Käänteiskopiointi-PCR (RT-PCR) on herkkä, spesifinen ja nopea menetelmä RNA molekyylien monistamiseen. RT-PCR:n avulla vain elävien pilaajabakteerien osoittaminen näytteestä voi olla mahdollista. Elävät pilaajamikrobit, jotka pystyvät lisääntymään panimoissa ja/tai valmiissa oluessa, aiheuttavat suurimman hygieniariskin panimoteollisuudelle. Tässä työssä tutkittiin reaaliaikaisen RT-PCR:n soveltuvuutta elävien Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri ja Pediococcus damnosus -bakteerien osoittamiseen. Lisäksi verrattiin erilaisia RNA-eristysmenetelmiä. RT-PCR:n kohdegeeneiksi valittiin geenit, joiden määrä solussa on riittävän suuri ja ekspressio elävässä solussa konstitutiivistä. Työssä käytetyt kohdegeenit olivat 16S rRNA ja transkription elongaatiofaktorin (Ef-TU) mRNA. RT-PCR suoritettiin yksivaiheisena reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR-menetelmällä (LightCyclerTM, Roche). Työssä vertailtiin myös erilaisten tappokäsittelyjen (kuumennus, desinfiointiaine) vaikutusta kohde-RNA:n hajoamiseen kuolleesta solusta. Eri menetelmillä tapettuja soluja inkuboitiin huoneenlämpötilassa kolmen viikon ajan, jonka aikana kohde-RNA:n hajoamista seurattiin RT-PCR -menetelmän avulla. Vaikka RNA:n määrän todettiinkin hitaasti vähenevän inkubointiajan funktiona sekä kuumentamalla että desinfiointiaineella tapetuista soluista, RNA kohdemolekyylit (16S rRNA ja Ef-TU mRNA) monistuivat RT-PCR:ssä vielä kolme viikkoa tappokäsittelyjen jälkeen. Näin oluen menetelmän ei todettu soveltuvan sellaisenaan elävien oluenpilaajabakteerien osoittamiseen.
Original languageFinnish
QualificationMaster Degree
Awarding Institution
  • University of Helsinki
Place of PublicationHelsinki
Publisher
Publication statusPublished - 2004
MoE publication typeG2 Master's thesis, polytechnic Master's thesis

Keywords

  • oluenpilaajabakteeri
  • elävyys
  • RT-PCR

Cite this

Partanen, T. (2004). RT-PCR:n soveltuvuus elävien oluenpilaajabakteerien osoittamiseen: Pro gradu. Helsinki: University of Helsinki.
Partanen, Tiina. / RT-PCR:n soveltuvuus elävien oluenpilaajabakteerien osoittamiseen : Pro gradu. Helsinki : University of Helsinki, 2004. 73 p.
@phdthesis{4b778d664549474595668474792b4020,
title = "RT-PCR:n soveltuvuus el{\"a}vien oluenpilaajabakteerien osoittamiseen: Pro gradu",
abstract = "Oluessa ja panimoissa el{\"a}m{\"a}{\"a}n sopeutuneita pilaajabakteereita ovat mm. er{\"a}{\"a}t Lactobacillus ja Pediococcus -sukujen maitohappobakteerit, anaerobiset Pectinatus ja Megasphaera -sukujen bakteerit, sek{\"a} harvinaisemmat Obesumbacterium proteus ja Zymomonas mobilis. Maitohappobakteerit ovat yleisimpi{\"a} olutta pilaavia bakteereita. Lis{\"a}ksi erilaiset hiivat voivat pilata olutta. Pilaajamikrobit aiheuttavat oluen samentumista ja erilaisia haju- ja makuvirheit{\"a}. Mikrobit osoitetaan panimoissa viljelyyn perustuvilla menetelmill{\"a}, jotka ovat usein melko hitaita (3-7 vrk). PCR:{\"a}{\"a}n perustuvat menetelm{\"a}t ovat nopeita ja herkki{\"a}, ja niit{\"a} on sovellettu my{\"o}s panimoiden laadunvalvontaan. Perinteisen PCR:n, jossa osoitetaan DNA:ta, huonona puolena on se, ett{\"a} menetelm{\"a}n avulla ei kyet{\"a} erottamaan el{\"a}vi{\"a} ja kuolleita pilaajabakteereita toisistaan, koska DNA s{\"a}ilyy kuolleissa soluissa stabiilina pitki{\"a} aikoja. RNA on DNA:ta ep{\"a}stabiilimpi molekyyli, joka hajoaa yleens{\"a} kuolleesta solusta DNA:ta nopeammin. K{\"a}{\"a}nteiskopiointi-PCR (RT-PCR) on herkk{\"a}, spesifinen ja nopea menetelm{\"a} RNA molekyylien monistamiseen. RT-PCR:n avulla vain el{\"a}vien pilaajabakteerien osoittaminen n{\"a}ytteest{\"a} voi olla mahdollista. El{\"a}v{\"a}t pilaajamikrobit, jotka pystyv{\"a}t lis{\"a}{\"a}ntym{\"a}{\"a}n panimoissa ja/tai valmiissa oluessa, aiheuttavat suurimman hygieniariskin panimoteollisuudelle. T{\"a}ss{\"a} ty{\"o}ss{\"a} tutkittiin reaaliaikaisen RT-PCR:n soveltuvuutta el{\"a}vien Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri ja Pediococcus damnosus -bakteerien osoittamiseen. Lis{\"a}ksi verrattiin erilaisia RNA-eristysmenetelmi{\"a}. RT-PCR:n kohdegeeneiksi valittiin geenit, joiden m{\"a}{\"a}r{\"a} solussa on riitt{\"a}v{\"a}n suuri ja ekspressio el{\"a}v{\"a}ss{\"a} solussa konstitutiivist{\"a}. Ty{\"o}ss{\"a} k{\"a}ytetyt kohdegeenit olivat 16S rRNA ja transkription elongaatiofaktorin (Ef-TU) mRNA. RT-PCR suoritettiin yksivaiheisena reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR-menetelm{\"a}ll{\"a} (LightCyclerTM, Roche). Ty{\"o}ss{\"a} vertailtiin my{\"o}s erilaisten tappok{\"a}sittelyjen (kuumennus, desinfiointiaine) vaikutusta kohde-RNA:n hajoamiseen kuolleesta solusta. Eri menetelmill{\"a} tapettuja soluja inkuboitiin huoneenl{\"a}mp{\"o}tilassa kolmen viikon ajan, jonka aikana kohde-RNA:n hajoamista seurattiin RT-PCR -menetelm{\"a}n avulla. Vaikka RNA:n m{\"a}{\"a}r{\"a}n todettiinkin hitaasti v{\"a}henev{\"a}n inkubointiajan funktiona sek{\"a} kuumentamalla ett{\"a} desinfiointiaineella tapetuista soluista, RNA kohdemolekyylit (16S rRNA ja Ef-TU mRNA) monistuivat RT-PCR:ss{\"a} viel{\"a} kolme viikkoa tappok{\"a}sittelyjen j{\"a}lkeen. N{\"a}in oluen menetelm{\"a}n ei todettu soveltuvan sellaisenaan el{\"a}vien oluenpilaajabakteerien osoittamiseen.",
keywords = "oluenpilaajabakteeri, el{\"a}vyys, RT-PCR",
author = "Tiina Partanen",
note = "CA: BEL pro gradu Helsingin yliopisto, Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitos 73 s. + liitt.",
year = "2004",
language = "Finnish",
publisher = "University of Helsinki",
address = "Finland",
school = "University of Helsinki",

}

Partanen, T 2004, 'RT-PCR:n soveltuvuus elävien oluenpilaajabakteerien osoittamiseen: Pro gradu', Master Degree, University of Helsinki, Helsinki.

RT-PCR:n soveltuvuus elävien oluenpilaajabakteerien osoittamiseen : Pro gradu. / Partanen, Tiina.

Helsinki : University of Helsinki, 2004. 73 p.

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

TY - THES

T1 - RT-PCR:n soveltuvuus elävien oluenpilaajabakteerien osoittamiseen

T2 - Pro gradu

AU - Partanen, Tiina

N1 - CA: BEL pro gradu Helsingin yliopisto, Soveltavan kemian ja mikrobiologian laitos 73 s. + liitt.

PY - 2004

Y1 - 2004

N2 - Oluessa ja panimoissa elämään sopeutuneita pilaajabakteereita ovat mm. eräät Lactobacillus ja Pediococcus -sukujen maitohappobakteerit, anaerobiset Pectinatus ja Megasphaera -sukujen bakteerit, sekä harvinaisemmat Obesumbacterium proteus ja Zymomonas mobilis. Maitohappobakteerit ovat yleisimpiä olutta pilaavia bakteereita. Lisäksi erilaiset hiivat voivat pilata olutta. Pilaajamikrobit aiheuttavat oluen samentumista ja erilaisia haju- ja makuvirheitä. Mikrobit osoitetaan panimoissa viljelyyn perustuvilla menetelmillä, jotka ovat usein melko hitaita (3-7 vrk). PCR:ään perustuvat menetelmät ovat nopeita ja herkkiä, ja niitä on sovellettu myös panimoiden laadunvalvontaan. Perinteisen PCR:n, jossa osoitetaan DNA:ta, huonona puolena on se, että menetelmän avulla ei kyetä erottamaan eläviä ja kuolleita pilaajabakteereita toisistaan, koska DNA säilyy kuolleissa soluissa stabiilina pitkiä aikoja. RNA on DNA:ta epästabiilimpi molekyyli, joka hajoaa yleensä kuolleesta solusta DNA:ta nopeammin. Käänteiskopiointi-PCR (RT-PCR) on herkkä, spesifinen ja nopea menetelmä RNA molekyylien monistamiseen. RT-PCR:n avulla vain elävien pilaajabakteerien osoittaminen näytteestä voi olla mahdollista. Elävät pilaajamikrobit, jotka pystyvät lisääntymään panimoissa ja/tai valmiissa oluessa, aiheuttavat suurimman hygieniariskin panimoteollisuudelle. Tässä työssä tutkittiin reaaliaikaisen RT-PCR:n soveltuvuutta elävien Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri ja Pediococcus damnosus -bakteerien osoittamiseen. Lisäksi verrattiin erilaisia RNA-eristysmenetelmiä. RT-PCR:n kohdegeeneiksi valittiin geenit, joiden määrä solussa on riittävän suuri ja ekspressio elävässä solussa konstitutiivistä. Työssä käytetyt kohdegeenit olivat 16S rRNA ja transkription elongaatiofaktorin (Ef-TU) mRNA. RT-PCR suoritettiin yksivaiheisena reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR-menetelmällä (LightCyclerTM, Roche). Työssä vertailtiin myös erilaisten tappokäsittelyjen (kuumennus, desinfiointiaine) vaikutusta kohde-RNA:n hajoamiseen kuolleesta solusta. Eri menetelmillä tapettuja soluja inkuboitiin huoneenlämpötilassa kolmen viikon ajan, jonka aikana kohde-RNA:n hajoamista seurattiin RT-PCR -menetelmän avulla. Vaikka RNA:n määrän todettiinkin hitaasti vähenevän inkubointiajan funktiona sekä kuumentamalla että desinfiointiaineella tapetuista soluista, RNA kohdemolekyylit (16S rRNA ja Ef-TU mRNA) monistuivat RT-PCR:ssä vielä kolme viikkoa tappokäsittelyjen jälkeen. Näin oluen menetelmän ei todettu soveltuvan sellaisenaan elävien oluenpilaajabakteerien osoittamiseen.

AB - Oluessa ja panimoissa elämään sopeutuneita pilaajabakteereita ovat mm. eräät Lactobacillus ja Pediococcus -sukujen maitohappobakteerit, anaerobiset Pectinatus ja Megasphaera -sukujen bakteerit, sekä harvinaisemmat Obesumbacterium proteus ja Zymomonas mobilis. Maitohappobakteerit ovat yleisimpiä olutta pilaavia bakteereita. Lisäksi erilaiset hiivat voivat pilata olutta. Pilaajamikrobit aiheuttavat oluen samentumista ja erilaisia haju- ja makuvirheitä. Mikrobit osoitetaan panimoissa viljelyyn perustuvilla menetelmillä, jotka ovat usein melko hitaita (3-7 vrk). PCR:ään perustuvat menetelmät ovat nopeita ja herkkiä, ja niitä on sovellettu myös panimoiden laadunvalvontaan. Perinteisen PCR:n, jossa osoitetaan DNA:ta, huonona puolena on se, että menetelmän avulla ei kyetä erottamaan eläviä ja kuolleita pilaajabakteereita toisistaan, koska DNA säilyy kuolleissa soluissa stabiilina pitkiä aikoja. RNA on DNA:ta epästabiilimpi molekyyli, joka hajoaa yleensä kuolleesta solusta DNA:ta nopeammin. Käänteiskopiointi-PCR (RT-PCR) on herkkä, spesifinen ja nopea menetelmä RNA molekyylien monistamiseen. RT-PCR:n avulla vain elävien pilaajabakteerien osoittaminen näytteestä voi olla mahdollista. Elävät pilaajamikrobit, jotka pystyvät lisääntymään panimoissa ja/tai valmiissa oluessa, aiheuttavat suurimman hygieniariskin panimoteollisuudelle. Tässä työssä tutkittiin reaaliaikaisen RT-PCR:n soveltuvuutta elävien Lactobacillus brevis, Lactobacillus lindneri ja Pediococcus damnosus -bakteerien osoittamiseen. Lisäksi verrattiin erilaisia RNA-eristysmenetelmiä. RT-PCR:n kohdegeeneiksi valittiin geenit, joiden määrä solussa on riittävän suuri ja ekspressio elävässä solussa konstitutiivistä. Työssä käytetyt kohdegeenit olivat 16S rRNA ja transkription elongaatiofaktorin (Ef-TU) mRNA. RT-PCR suoritettiin yksivaiheisena reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR-menetelmällä (LightCyclerTM, Roche). Työssä vertailtiin myös erilaisten tappokäsittelyjen (kuumennus, desinfiointiaine) vaikutusta kohde-RNA:n hajoamiseen kuolleesta solusta. Eri menetelmillä tapettuja soluja inkuboitiin huoneenlämpötilassa kolmen viikon ajan, jonka aikana kohde-RNA:n hajoamista seurattiin RT-PCR -menetelmän avulla. Vaikka RNA:n määrän todettiinkin hitaasti vähenevän inkubointiajan funktiona sekä kuumentamalla että desinfiointiaineella tapetuista soluista, RNA kohdemolekyylit (16S rRNA ja Ef-TU mRNA) monistuivat RT-PCR:ssä vielä kolme viikkoa tappokäsittelyjen jälkeen. Näin oluen menetelmän ei todettu soveltuvan sellaisenaan elävien oluenpilaajabakteerien osoittamiseen.

KW - oluenpilaajabakteeri

KW - elävyys

KW - RT-PCR

M3 - Master's thesis

PB - University of Helsinki

CY - Helsinki

ER -

Partanen T. RT-PCR:n soveltuvuus elävien oluenpilaajabakteerien osoittamiseen: Pro gradu. Helsinki: University of Helsinki, 2004. 73 p.