Solunsisäisten yksiketjuisten anti-Sem1p-vasta-aineiden kehittäminen: Pro gradu

Katri Niemi

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

Abstract

Solunsisäinen immunisaatio on tapahtuma, jossa solussa tuotetut kokonaiset tai pienennetyt vasta-aineet ohjataan pois normaalilta eritysreitiltä ja kohdennetaan soluliman organelleihin erityisten signaalisekvenssien avulla. Kohdentamisen tarkoituksena on säädellä, yleisimmin inhiboida, antigeenin toimintaa solunsisäisissä olosuhteissa. Tekniikalla voi olla sovelluksia niin terapiassa kuin molekyylibiologisessa perustutkimuksessakin. Pienennetyistä vasta-aineista yksiketjuisella vasta-aineella, nk. scFv-fragmentilla, on monia suotuisia ominaisuuksia. ScFv-fragmentti sisältää vain antigeenin sitomiseen tarvittavat alueet, VH- ja VL-domeenit, joita yhdistää keinotekoinen liitospeptidi. ScFv-fragmentin laajempaa hyödyntämistä solunsisäisenä vasta-aineena rajoittaa sen alhainen stabiilisuus solun sisällä. Soluliman pelkistävät olosuhteet eivät suosi ketjunsisäisten rikkisiltojen muodostumista, ja tämä vaikuttaa usein negatiivisesti scFv-fragmentin laskostumiseen ja sisäiseen stabiilisuuteen. Erilaisilla proteiininmuokkausmenetelmillä, kuten CDR-silmukoiden siirrolla, aminohappovaihdoksilla tai fuusioproteiinitekniikalla, on kuitenkin mahdollista parantaa scFv-fragmentin stabiilisuutta. Lisäksi in vivo seulontamenetelmillä, kuten hiivan kaksihybriditekniikalla, voidaan seuloa suoraan solunsisäisissä olosuhteissa stabiileja ja toimivia scFv-fragmentteja. Työssä käytettiin malliproteiinina Saccharomyces cerevisiae -hiivan Sem1-proteiinia. SEM1-geeni kloonattiin ensimmäisenä eksokystikompleksin erään lämpöherkän mutantin supressorina. On myös havaittu, että SEM1-geenin poisto tai vaihtoehtoisesti Sem1-proteiinia inhiboivien vasta-aineiden ilmentäminen hidastaa hiivasolujen kasvua tietyissä olosuhteissa. Sinällään Sem1-proteiinin funktio on kuitenkin tuntematon, mutta sen ihmishomologia (DSS1) on jo yhdistetty rintasyöpään sekä erääseen raajojen kehityshäiriöön. Työssä kokeellisessa osuudessa tutkittiin mahdollisuutta parantaa yksinketjuisen anti-Sem1p-vasta-aineen solunsisäistä stabiilisuutta, toiminnallisuutta sekä tuottotasoa fuusioproteiinitekniikalla. Muokattava scFv-fragmentti oli aiemmin VTT:llä eristetty ihmisen immunisoimattomasta scFv-faagikirjastosta. Fuusioproteiiniksi valittiin GFP, vihreä fluoresoiva proteiini, ennen kaikkea sen fluoresenssiominaisuuksien mutta myös sen mahdollisen stabiloivan vaikutuksen vuoksi. GFP fuusioitiin scFv-fragmentin N-terminaaliseen päähän ja saatujen GFP-fuusioiden ominaisuuksia analysoitiin immunopresipitaatioilla, Sem1p:n in vitro -sitomiskokeilla, immunofluoresenssimikroskopialla sekä kasvuinhibitiokokeilla. Vertailua tehtiin fuusioimattomaan scFv-fragmenttiin sekä siitä aiemmin rakennettuun Fab-muotoiseen fragmenttiin. Havaittiin, että toiminnallinen tuottotaso ts. proteiinin määrä hajotettujen hiivasolujen liukoisessa osassa koheni selvästi ja myös Sem1p:n sitominen in vitro tehostui. Immunofluoresenssikokeet antoivat lisäksi hienoisia viitteitä fuusioiden toimivuudesta in vivo. Sen sijaan kasvuinhibitiokokeet osoittivat, että GFP-fuusiot eivät olleet aktiivisia solun sisällä. Mitään ilmeistä syytä GFP-fuusioiden inaktiivisuudelle tai koetulosten osittaiselle ristiriitaisuudelle ei ollut havaittavissa. Mahdollisina virhelähteinä voidaan pitää esimerkiksi kokeiden suorituksessa ilmenneitä hankaluuksia ja teknisiä ongelmia. Myös scFv-fragmenttien erityisominaisuuksilla, kuten dimerisaatiotaipumuksella, on saattanut olla vaikutusta. Lisäkokeita kuitenkin tarvittaisiin ennen kuin mitään tarkempaa pystyy arvioimaan. Kaiken kaikkiaan näyttää kuitenkin siltä, ettei fuusioproteiinitekniikka ole ehkä optimaalisin muokkausmenetelmä solunsisäisille Sem1p-spesifisille vasta-aineille.
Original languageFinnish
QualificationMaster Degree
Awarding Institution
  • University of Helsinki
Place of PublicationHelsinki
Publisher
Publication statusPublished - 2003
MoE publication typeG2 Master's thesis, polytechnic Master's thesis

Keywords

  • pienennetty vasta-aine
  • scFv, stabiilisuus
  • fuusioproteiinitekniikka
  • GFP
  • Sem1-proteiini

Cite this