Solunsisäisten yksiketjuisten anti-Sem1p-vasta-aineiden kehittäminen: Pro gradu

Katri Niemi

Research output: ThesisMaster's thesis

Abstract

Solunsisäinen immunisaatio on tapahtuma, jossa solussa tuotetut kokonaiset tai pienennetyt vasta-aineet ohjataan pois normaalilta eritysreitiltä ja kohdennetaan soluliman organelleihin erityisten signaalisekvenssien avulla. Kohdentamisen tarkoituksena on säädellä, yleisimmin inhiboida, antigeenin toimintaa solunsisäisissä olosuhteissa. Tekniikalla voi olla sovelluksia niin terapiassa kuin molekyylibiologisessa perustutkimuksessakin. Pienennetyistä vasta-aineista yksiketjuisella vasta-aineella, nk. scFv-fragmentilla, on monia suotuisia ominaisuuksia. ScFv-fragmentti sisältää vain antigeenin sitomiseen tarvittavat alueet, VH- ja VL-domeenit, joita yhdistää keinotekoinen liitospeptidi. ScFv-fragmentin laajempaa hyödyntämistä solunsisäisenä vasta-aineena rajoittaa sen alhainen stabiilisuus solun sisällä. Soluliman pelkistävät olosuhteet eivät suosi ketjunsisäisten rikkisiltojen muodostumista, ja tämä vaikuttaa usein negatiivisesti scFv-fragmentin laskostumiseen ja sisäiseen stabiilisuuteen. Erilaisilla proteiininmuokkausmenetelmillä, kuten CDR-silmukoiden siirrolla, aminohappovaihdoksilla tai fuusioproteiinitekniikalla, on kuitenkin mahdollista parantaa scFv-fragmentin stabiilisuutta. Lisäksi in vivo seulontamenetelmillä, kuten hiivan kaksihybriditekniikalla, voidaan seuloa suoraan solunsisäisissä olosuhteissa stabiileja ja toimivia scFv-fragmentteja. Työssä käytettiin malliproteiinina Saccharomyces cerevisiae -hiivan Sem1-proteiinia. SEM1-geeni kloonattiin ensimmäisenä eksokystikompleksin erään lämpöherkän mutantin supressorina. On myös havaittu, että SEM1-geenin poisto tai vaihtoehtoisesti Sem1-proteiinia inhiboivien vasta-aineiden ilmentäminen hidastaa hiivasolujen kasvua tietyissä olosuhteissa. Sinällään Sem1-proteiinin funktio on kuitenkin tuntematon, mutta sen ihmishomologia (DSS1) on jo yhdistetty rintasyöpään sekä erääseen raajojen kehityshäiriöön. Työssä kokeellisessa osuudessa tutkittiin mahdollisuutta parantaa yksinketjuisen anti-Sem1p-vasta-aineen solunsisäistä stabiilisuutta, toiminnallisuutta sekä tuottotasoa fuusioproteiinitekniikalla. Muokattava scFv-fragmentti oli aiemmin VTT:llä eristetty ihmisen immunisoimattomasta scFv-faagikirjastosta. Fuusioproteiiniksi valittiin GFP, vihreä fluoresoiva proteiini, ennen kaikkea sen fluoresenssiominaisuuksien mutta myös sen mahdollisen stabiloivan vaikutuksen vuoksi. GFP fuusioitiin scFv-fragmentin N-terminaaliseen päähän ja saatujen GFP-fuusioiden ominaisuuksia analysoitiin immunopresipitaatioilla, Sem1p:n in vitro -sitomiskokeilla, immunofluoresenssimikroskopialla sekä kasvuinhibitiokokeilla. Vertailua tehtiin fuusioimattomaan scFv-fragmenttiin sekä siitä aiemmin rakennettuun Fab-muotoiseen fragmenttiin. Havaittiin, että toiminnallinen tuottotaso ts. proteiinin määrä hajotettujen hiivasolujen liukoisessa osassa koheni selvästi ja myös Sem1p:n sitominen in vitro tehostui. Immunofluoresenssikokeet antoivat lisäksi hienoisia viitteitä fuusioiden toimivuudesta in vivo. Sen sijaan kasvuinhibitiokokeet osoittivat, että GFP-fuusiot eivät olleet aktiivisia solun sisällä. Mitään ilmeistä syytä GFP-fuusioiden inaktiivisuudelle tai koetulosten osittaiselle ristiriitaisuudelle ei ollut havaittavissa. Mahdollisina virhelähteinä voidaan pitää esimerkiksi kokeiden suorituksessa ilmenneitä hankaluuksia ja teknisiä ongelmia. Myös scFv-fragmenttien erityisominaisuuksilla, kuten dimerisaatiotaipumuksella, on saattanut olla vaikutusta. Lisäkokeita kuitenkin tarvittaisiin ennen kuin mitään tarkempaa pystyy arvioimaan. Kaiken kaikkiaan näyttää kuitenkin siltä, ettei fuusioproteiinitekniikka ole ehkä optimaalisin muokkausmenetelmä solunsisäisille Sem1p-spesifisille vasta-aineille.
Original languageFinnish
QualificationMaster Degree
Awarding Institution
  • University of Helsinki
Place of PublicationHelsinki
Publisher
Publication statusPublished - 2003
MoE publication typeG2 Master's thesis, polytechnic Master's thesis

Keywords

  • pienennetty vasta-aine
  • scFv, stabiilisuus
  • fuusioproteiinitekniikka
  • GFP
  • Sem1-proteiini

Cite this

Niemi, Katri. / Solunsisäisten yksiketjuisten anti-Sem1p-vasta-aineiden kehittäminen : Pro gradu. Helsinki : University of Helsinki, 2003. 68 p.
@phdthesis{cb209b69ce9f4089872804a29aecd65a,
title = "Solunsis{\"a}isten yksiketjuisten anti-Sem1p-vasta-aineiden kehitt{\"a}minen: Pro gradu",
abstract = "Solunsis{\"a}inen immunisaatio on tapahtuma, jossa solussa tuotetut kokonaiset tai pienennetyt vasta-aineet ohjataan pois normaalilta eritysreitilt{\"a} ja kohdennetaan soluliman organelleihin erityisten signaalisekvenssien avulla. Kohdentamisen tarkoituksena on s{\"a}{\"a}dell{\"a}, yleisimmin inhiboida, antigeenin toimintaa solunsis{\"a}isiss{\"a} olosuhteissa. Tekniikalla voi olla sovelluksia niin terapiassa kuin molekyylibiologisessa perustutkimuksessakin. Pienennetyist{\"a} vasta-aineista yksiketjuisella vasta-aineella, nk. scFv-fragmentilla, on monia suotuisia ominaisuuksia. ScFv-fragmentti sis{\"a}lt{\"a}{\"a} vain antigeenin sitomiseen tarvittavat alueet, VH- ja VL-domeenit, joita yhdist{\"a}{\"a} keinotekoinen liitospeptidi. ScFv-fragmentin laajempaa hy{\"o}dynt{\"a}mist{\"a} solunsis{\"a}isen{\"a} vasta-aineena rajoittaa sen alhainen stabiilisuus solun sis{\"a}ll{\"a}. Soluliman pelkist{\"a}v{\"a}t olosuhteet eiv{\"a}t suosi ketjunsis{\"a}isten rikkisiltojen muodostumista, ja t{\"a}m{\"a} vaikuttaa usein negatiivisesti scFv-fragmentin laskostumiseen ja sis{\"a}iseen stabiilisuuteen. Erilaisilla proteiininmuokkausmenetelmill{\"a}, kuten CDR-silmukoiden siirrolla, aminohappovaihdoksilla tai fuusioproteiinitekniikalla, on kuitenkin mahdollista parantaa scFv-fragmentin stabiilisuutta. Lis{\"a}ksi in vivo seulontamenetelmill{\"a}, kuten hiivan kaksihybriditekniikalla, voidaan seuloa suoraan solunsis{\"a}isiss{\"a} olosuhteissa stabiileja ja toimivia scFv-fragmentteja. Ty{\"o}ss{\"a} k{\"a}ytettiin malliproteiinina Saccharomyces cerevisiae -hiivan Sem1-proteiinia. SEM1-geeni kloonattiin ensimm{\"a}isen{\"a} eksokystikompleksin er{\"a}{\"a}n l{\"a}mp{\"o}herk{\"a}n mutantin supressorina. On my{\"o}s havaittu, ett{\"a} SEM1-geenin poisto tai vaihtoehtoisesti Sem1-proteiinia inhiboivien vasta-aineiden ilment{\"a}minen hidastaa hiivasolujen kasvua tietyiss{\"a} olosuhteissa. Sin{\"a}ll{\"a}{\"a}n Sem1-proteiinin funktio on kuitenkin tuntematon, mutta sen ihmishomologia (DSS1) on jo yhdistetty rintasy{\"o}p{\"a}{\"a}n sek{\"a} er{\"a}{\"a}seen raajojen kehitysh{\"a}iri{\"o}{\"o}n. Ty{\"o}ss{\"a} kokeellisessa osuudessa tutkittiin mahdollisuutta parantaa yksinketjuisen anti-Sem1p-vasta-aineen solunsis{\"a}ist{\"a} stabiilisuutta, toiminnallisuutta sek{\"a} tuottotasoa fuusioproteiinitekniikalla. Muokattava scFv-fragmentti oli aiemmin VTT:ll{\"a} eristetty ihmisen immunisoimattomasta scFv-faagikirjastosta. Fuusioproteiiniksi valittiin GFP, vihre{\"a} fluoresoiva proteiini, ennen kaikkea sen fluoresenssiominaisuuksien mutta my{\"o}s sen mahdollisen stabiloivan vaikutuksen vuoksi. GFP fuusioitiin scFv-fragmentin N-terminaaliseen p{\"a}{\"a}h{\"a}n ja saatujen GFP-fuusioiden ominaisuuksia analysoitiin immunopresipitaatioilla, Sem1p:n in vitro -sitomiskokeilla, immunofluoresenssimikroskopialla sek{\"a} kasvuinhibitiokokeilla. Vertailua tehtiin fuusioimattomaan scFv-fragmenttiin sek{\"a} siit{\"a} aiemmin rakennettuun Fab-muotoiseen fragmenttiin. Havaittiin, ett{\"a} toiminnallinen tuottotaso ts. proteiinin m{\"a}{\"a}r{\"a} hajotettujen hiivasolujen liukoisessa osassa koheni selv{\"a}sti ja my{\"o}s Sem1p:n sitominen in vitro tehostui. Immunofluoresenssikokeet antoivat lis{\"a}ksi hienoisia viitteit{\"a} fuusioiden toimivuudesta in vivo. Sen sijaan kasvuinhibitiokokeet osoittivat, ett{\"a} GFP-fuusiot eiv{\"a}t olleet aktiivisia solun sis{\"a}ll{\"a}. Mit{\"a}{\"a}n ilmeist{\"a} syyt{\"a} GFP-fuusioiden inaktiivisuudelle tai koetulosten osittaiselle ristiriitaisuudelle ei ollut havaittavissa. Mahdollisina virhel{\"a}htein{\"a} voidaan pit{\"a}{\"a} esimerkiksi kokeiden suorituksessa ilmenneit{\"a} hankaluuksia ja teknisi{\"a} ongelmia. My{\"o}s scFv-fragmenttien erityisominaisuuksilla, kuten dimerisaatiotaipumuksella, on saattanut olla vaikutusta. Lis{\"a}kokeita kuitenkin tarvittaisiin ennen kuin mit{\"a}{\"a}n tarkempaa pystyy arvioimaan. Kaiken kaikkiaan n{\"a}ytt{\"a}{\"a} kuitenkin silt{\"a}, ettei fuusioproteiinitekniikka ole ehk{\"a} optimaalisin muokkausmenetelm{\"a} solunsis{\"a}isille Sem1p-spesifisille vasta-aineille.",
keywords = "pienennetty vasta-aine, scFv, stabiilisuus, fuusioproteiinitekniikka, GFP, Sem1-proteiini",
author = "Katri Niemi",
note = "CA: BEL pro gradu Helsingin yliopisto, Biotieteiden laitos, Biokemian osasto",
year = "2003",
language = "Finnish",
publisher = "University of Helsinki",
address = "Finland",
school = "University of Helsinki",

}

Niemi, K 2003, 'Solunsisäisten yksiketjuisten anti-Sem1p-vasta-aineiden kehittäminen: Pro gradu', Master Degree, University of Helsinki, Helsinki.

Solunsisäisten yksiketjuisten anti-Sem1p-vasta-aineiden kehittäminen : Pro gradu. / Niemi, Katri.

Helsinki : University of Helsinki, 2003. 68 p.

Research output: ThesisMaster's thesis

TY - THES

T1 - Solunsisäisten yksiketjuisten anti-Sem1p-vasta-aineiden kehittäminen

T2 - Pro gradu

AU - Niemi, Katri

N1 - CA: BEL pro gradu Helsingin yliopisto, Biotieteiden laitos, Biokemian osasto

PY - 2003

Y1 - 2003

N2 - Solunsisäinen immunisaatio on tapahtuma, jossa solussa tuotetut kokonaiset tai pienennetyt vasta-aineet ohjataan pois normaalilta eritysreitiltä ja kohdennetaan soluliman organelleihin erityisten signaalisekvenssien avulla. Kohdentamisen tarkoituksena on säädellä, yleisimmin inhiboida, antigeenin toimintaa solunsisäisissä olosuhteissa. Tekniikalla voi olla sovelluksia niin terapiassa kuin molekyylibiologisessa perustutkimuksessakin. Pienennetyistä vasta-aineista yksiketjuisella vasta-aineella, nk. scFv-fragmentilla, on monia suotuisia ominaisuuksia. ScFv-fragmentti sisältää vain antigeenin sitomiseen tarvittavat alueet, VH- ja VL-domeenit, joita yhdistää keinotekoinen liitospeptidi. ScFv-fragmentin laajempaa hyödyntämistä solunsisäisenä vasta-aineena rajoittaa sen alhainen stabiilisuus solun sisällä. Soluliman pelkistävät olosuhteet eivät suosi ketjunsisäisten rikkisiltojen muodostumista, ja tämä vaikuttaa usein negatiivisesti scFv-fragmentin laskostumiseen ja sisäiseen stabiilisuuteen. Erilaisilla proteiininmuokkausmenetelmillä, kuten CDR-silmukoiden siirrolla, aminohappovaihdoksilla tai fuusioproteiinitekniikalla, on kuitenkin mahdollista parantaa scFv-fragmentin stabiilisuutta. Lisäksi in vivo seulontamenetelmillä, kuten hiivan kaksihybriditekniikalla, voidaan seuloa suoraan solunsisäisissä olosuhteissa stabiileja ja toimivia scFv-fragmentteja. Työssä käytettiin malliproteiinina Saccharomyces cerevisiae -hiivan Sem1-proteiinia. SEM1-geeni kloonattiin ensimmäisenä eksokystikompleksin erään lämpöherkän mutantin supressorina. On myös havaittu, että SEM1-geenin poisto tai vaihtoehtoisesti Sem1-proteiinia inhiboivien vasta-aineiden ilmentäminen hidastaa hiivasolujen kasvua tietyissä olosuhteissa. Sinällään Sem1-proteiinin funktio on kuitenkin tuntematon, mutta sen ihmishomologia (DSS1) on jo yhdistetty rintasyöpään sekä erääseen raajojen kehityshäiriöön. Työssä kokeellisessa osuudessa tutkittiin mahdollisuutta parantaa yksinketjuisen anti-Sem1p-vasta-aineen solunsisäistä stabiilisuutta, toiminnallisuutta sekä tuottotasoa fuusioproteiinitekniikalla. Muokattava scFv-fragmentti oli aiemmin VTT:llä eristetty ihmisen immunisoimattomasta scFv-faagikirjastosta. Fuusioproteiiniksi valittiin GFP, vihreä fluoresoiva proteiini, ennen kaikkea sen fluoresenssiominaisuuksien mutta myös sen mahdollisen stabiloivan vaikutuksen vuoksi. GFP fuusioitiin scFv-fragmentin N-terminaaliseen päähän ja saatujen GFP-fuusioiden ominaisuuksia analysoitiin immunopresipitaatioilla, Sem1p:n in vitro -sitomiskokeilla, immunofluoresenssimikroskopialla sekä kasvuinhibitiokokeilla. Vertailua tehtiin fuusioimattomaan scFv-fragmenttiin sekä siitä aiemmin rakennettuun Fab-muotoiseen fragmenttiin. Havaittiin, että toiminnallinen tuottotaso ts. proteiinin määrä hajotettujen hiivasolujen liukoisessa osassa koheni selvästi ja myös Sem1p:n sitominen in vitro tehostui. Immunofluoresenssikokeet antoivat lisäksi hienoisia viitteitä fuusioiden toimivuudesta in vivo. Sen sijaan kasvuinhibitiokokeet osoittivat, että GFP-fuusiot eivät olleet aktiivisia solun sisällä. Mitään ilmeistä syytä GFP-fuusioiden inaktiivisuudelle tai koetulosten osittaiselle ristiriitaisuudelle ei ollut havaittavissa. Mahdollisina virhelähteinä voidaan pitää esimerkiksi kokeiden suorituksessa ilmenneitä hankaluuksia ja teknisiä ongelmia. Myös scFv-fragmenttien erityisominaisuuksilla, kuten dimerisaatiotaipumuksella, on saattanut olla vaikutusta. Lisäkokeita kuitenkin tarvittaisiin ennen kuin mitään tarkempaa pystyy arvioimaan. Kaiken kaikkiaan näyttää kuitenkin siltä, ettei fuusioproteiinitekniikka ole ehkä optimaalisin muokkausmenetelmä solunsisäisille Sem1p-spesifisille vasta-aineille.

AB - Solunsisäinen immunisaatio on tapahtuma, jossa solussa tuotetut kokonaiset tai pienennetyt vasta-aineet ohjataan pois normaalilta eritysreitiltä ja kohdennetaan soluliman organelleihin erityisten signaalisekvenssien avulla. Kohdentamisen tarkoituksena on säädellä, yleisimmin inhiboida, antigeenin toimintaa solunsisäisissä olosuhteissa. Tekniikalla voi olla sovelluksia niin terapiassa kuin molekyylibiologisessa perustutkimuksessakin. Pienennetyistä vasta-aineista yksiketjuisella vasta-aineella, nk. scFv-fragmentilla, on monia suotuisia ominaisuuksia. ScFv-fragmentti sisältää vain antigeenin sitomiseen tarvittavat alueet, VH- ja VL-domeenit, joita yhdistää keinotekoinen liitospeptidi. ScFv-fragmentin laajempaa hyödyntämistä solunsisäisenä vasta-aineena rajoittaa sen alhainen stabiilisuus solun sisällä. Soluliman pelkistävät olosuhteet eivät suosi ketjunsisäisten rikkisiltojen muodostumista, ja tämä vaikuttaa usein negatiivisesti scFv-fragmentin laskostumiseen ja sisäiseen stabiilisuuteen. Erilaisilla proteiininmuokkausmenetelmillä, kuten CDR-silmukoiden siirrolla, aminohappovaihdoksilla tai fuusioproteiinitekniikalla, on kuitenkin mahdollista parantaa scFv-fragmentin stabiilisuutta. Lisäksi in vivo seulontamenetelmillä, kuten hiivan kaksihybriditekniikalla, voidaan seuloa suoraan solunsisäisissä olosuhteissa stabiileja ja toimivia scFv-fragmentteja. Työssä käytettiin malliproteiinina Saccharomyces cerevisiae -hiivan Sem1-proteiinia. SEM1-geeni kloonattiin ensimmäisenä eksokystikompleksin erään lämpöherkän mutantin supressorina. On myös havaittu, että SEM1-geenin poisto tai vaihtoehtoisesti Sem1-proteiinia inhiboivien vasta-aineiden ilmentäminen hidastaa hiivasolujen kasvua tietyissä olosuhteissa. Sinällään Sem1-proteiinin funktio on kuitenkin tuntematon, mutta sen ihmishomologia (DSS1) on jo yhdistetty rintasyöpään sekä erääseen raajojen kehityshäiriöön. Työssä kokeellisessa osuudessa tutkittiin mahdollisuutta parantaa yksinketjuisen anti-Sem1p-vasta-aineen solunsisäistä stabiilisuutta, toiminnallisuutta sekä tuottotasoa fuusioproteiinitekniikalla. Muokattava scFv-fragmentti oli aiemmin VTT:llä eristetty ihmisen immunisoimattomasta scFv-faagikirjastosta. Fuusioproteiiniksi valittiin GFP, vihreä fluoresoiva proteiini, ennen kaikkea sen fluoresenssiominaisuuksien mutta myös sen mahdollisen stabiloivan vaikutuksen vuoksi. GFP fuusioitiin scFv-fragmentin N-terminaaliseen päähän ja saatujen GFP-fuusioiden ominaisuuksia analysoitiin immunopresipitaatioilla, Sem1p:n in vitro -sitomiskokeilla, immunofluoresenssimikroskopialla sekä kasvuinhibitiokokeilla. Vertailua tehtiin fuusioimattomaan scFv-fragmenttiin sekä siitä aiemmin rakennettuun Fab-muotoiseen fragmenttiin. Havaittiin, että toiminnallinen tuottotaso ts. proteiinin määrä hajotettujen hiivasolujen liukoisessa osassa koheni selvästi ja myös Sem1p:n sitominen in vitro tehostui. Immunofluoresenssikokeet antoivat lisäksi hienoisia viitteitä fuusioiden toimivuudesta in vivo. Sen sijaan kasvuinhibitiokokeet osoittivat, että GFP-fuusiot eivät olleet aktiivisia solun sisällä. Mitään ilmeistä syytä GFP-fuusioiden inaktiivisuudelle tai koetulosten osittaiselle ristiriitaisuudelle ei ollut havaittavissa. Mahdollisina virhelähteinä voidaan pitää esimerkiksi kokeiden suorituksessa ilmenneitä hankaluuksia ja teknisiä ongelmia. Myös scFv-fragmenttien erityisominaisuuksilla, kuten dimerisaatiotaipumuksella, on saattanut olla vaikutusta. Lisäkokeita kuitenkin tarvittaisiin ennen kuin mitään tarkempaa pystyy arvioimaan. Kaiken kaikkiaan näyttää kuitenkin siltä, ettei fuusioproteiinitekniikka ole ehkä optimaalisin muokkausmenetelmä solunsisäisille Sem1p-spesifisille vasta-aineille.

KW - pienennetty vasta-aine

KW - scFv, stabiilisuus

KW - fuusioproteiinitekniikka

KW - GFP

KW - Sem1-proteiini

M3 - Master's thesis

PB - University of Helsinki

CY - Helsinki

ER -

Niemi K. Solunsisäisten yksiketjuisten anti-Sem1p-vasta-aineiden kehittäminen: Pro gradu. Helsinki: University of Helsinki, 2003. 68 p.