Fuusioproteiinien peptidiketjun katkaisu metalli-ionien avulla

Diplomityö

Translated title of the contribution: Use of metal ions for linker cleavage in fusion proteins: Master's thesis

Sara Heilimo

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

Abstract

Työn kirjallisuusosassa on tarkasteltu fuusioproteiineja sekä fuusioproteiinitekniikan tarjoamia hyötyjä rekombinanttiproteiinien tuotossa. Fuusioproteiinien kemiallisia ja entsymaattisia katkaisumenetelmiä on tarkasteltu yksityiskohtaisesti. Kirjallisuusosassa on myös perehdytty kupari-ionien rooliin luonnossa. Metalli-ionien osallistumisesta proteiinien degradaatioon on kerrottu sekä tämän hetkiset tutkimustulokset kupari-ionien sekä rautakelaattien avulla tapahtuvasta proteiinien spesifisestä pilkkomisesta on esitelty. Työn kokeellisessa osassa tutkittiin kupari(II)ionilla tapahtuvaa fuusioproteiinin peptidiketjun katkeamisreaktiota. Fuusioproteiinin katkeaminen kahteen fuusioproteiinipartnereiden kokoa vastaaviin fragmentteihin saavutettiin kupari(II)ionin, askorbaatin sekä vetyperoksidin avulla noin tunnin inkuboinnilla. Reaktio-olosuhteiden vaikutusta katkaisureaktioon tutkittiin. Katkaisureaktion tehokkuutta sekä spesifisyyttä pystyttiin parantamaan vaihtelemalla pH:ta, puskuria, reaktiolämpötilaa, reaktioaikaa sekä suola-, kupari(II)ioni- ja vetyperoksidikonsentraatioita. Katkaisureaktion todettiin olevan nopea ja korkealla reaktiolämpötilalla oli reaktiota kiihdyttävä vaikutus. Reaktioliuoksen suolapitoisuus paransi olennaisesti reaktion spesifisyyttä. Katkaisureaktion saannon todettiin olevan heikko eikä sitä olosuhteiden parantelusta huolimatta pystytty olennaisesti parantamaan. Katkaisureaktion tarkka katkeamiskohta selvitettiin. Katkeamistuotteet erotettiin kromatografisesti ja niiden N-terminaalinen sekvenssi sekä molekyylipaino määritettiin. Katkeamisreaktiossa todettiin 73,2 kDa fuusioproteiinin pilkkoutuneen 31,2 ja 41,9 kDa fragmenteiksi ja katkaisureaktion todettiin olevan spesifinen peptidilinkkerin histidiini alueelle. Fuusioproteiinin N-terminaalisen katkeamistuotteen sekä katkeamattoman fuusioproteiinin N-terminukset olivat vahingoittumattomat. C-terminaalisen katkeamistuotteen N-terminaalista sekvenssiä ei saatu selville, johtuen todennäköisesti vapaan aminoryhmän puuttumisesta tai heterogeenisesta N-terminuksesta. Puhtaan fuusioproteiinin molekyylipainon todettiin olevan oletettua pienempi ja virhe fuusioproteiinin geenissä tai proteiinin katkeaminen läheltä C-terminusta fuusioproteiinin tuotossa osoittautui mandolliseksi. Kokeellisessa osassa tutkittu ilmiö on ollut tunnettu jo aiemmin, mutta sen spesifisyyttä ei ole aiemmin yritetty parantaa proteiinin muokkauksella. Nyt proteiinin spesifinen katkeaminen saavutettiin fuusioproteiiniin suunnitellusta erityisestä katkaisukohdasta. Kupari-ionien aiheuttama degradaatio pystyttiin ohjaamaan haluttuun kohtaan proteiinia histidiinijakson avulla.
Original languageFinnish
QualificationMaster Degree
Awarding Institution
  • Helsinki University of Technology
Place of PublicationEspoo
Publisher
Publication statusPublished - 2005
MoE publication typeG2 Master's thesis, polytechnic Master's thesis

Fingerprint

metal ions
proteins

Cite this

Heilimo, S. (2005). Fuusioproteiinien peptidiketjun katkaisu metalli-ionien avulla: Diplomityö. Espoo: Helsinki University of Technology.
Heilimo, Sara. / Fuusioproteiinien peptidiketjun katkaisu metalli-ionien avulla : Diplomityö. Espoo : Helsinki University of Technology, 2005. 101 p.
@phdthesis{fb0b9be07fc44a3e862bc5f5669d181c,
title = "Fuusioproteiinien peptidiketjun katkaisu metalli-ionien avulla: Diplomity{\"o}",
abstract = "Ty{\"o}n kirjallisuusosassa on tarkasteltu fuusioproteiineja sek{\"a} fuusioproteiinitekniikan tarjoamia hy{\"o}tyj{\"a} rekombinanttiproteiinien tuotossa. Fuusioproteiinien kemiallisia ja entsymaattisia katkaisumenetelmi{\"a} on tarkasteltu yksityiskohtaisesti. Kirjallisuusosassa on my{\"o}s perehdytty kupari-ionien rooliin luonnossa. Metalli-ionien osallistumisesta proteiinien degradaatioon on kerrottu sek{\"a} t{\"a}m{\"a}n hetkiset tutkimustulokset kupari-ionien sek{\"a} rautakelaattien avulla tapahtuvasta proteiinien spesifisest{\"a} pilkkomisesta on esitelty. Ty{\"o}n kokeellisessa osassa tutkittiin kupari(II)ionilla tapahtuvaa fuusioproteiinin peptidiketjun katkeamisreaktiota. Fuusioproteiinin katkeaminen kahteen fuusioproteiinipartnereiden kokoa vastaaviin fragmentteihin saavutettiin kupari(II)ionin, askorbaatin sek{\"a} vetyperoksidin avulla noin tunnin inkuboinnilla. Reaktio-olosuhteiden vaikutusta katkaisureaktioon tutkittiin. Katkaisureaktion tehokkuutta sek{\"a} spesifisyytt{\"a} pystyttiin parantamaan vaihtelemalla pH:ta, puskuria, reaktiol{\"a}mp{\"o}tilaa, reaktioaikaa sek{\"a} suola-, kupari(II)ioni- ja vetyperoksidikonsentraatioita. Katkaisureaktion todettiin olevan nopea ja korkealla reaktiol{\"a}mp{\"o}tilalla oli reaktiota kiihdytt{\"a}v{\"a} vaikutus. Reaktioliuoksen suolapitoisuus paransi olennaisesti reaktion spesifisyytt{\"a}. Katkaisureaktion saannon todettiin olevan heikko eik{\"a} sit{\"a} olosuhteiden parantelusta huolimatta pystytty olennaisesti parantamaan. Katkaisureaktion tarkka katkeamiskohta selvitettiin. Katkeamistuotteet erotettiin kromatografisesti ja niiden N-terminaalinen sekvenssi sek{\"a} molekyylipaino m{\"a}{\"a}ritettiin. Katkeamisreaktiossa todettiin 73,2 kDa fuusioproteiinin pilkkoutuneen 31,2 ja 41,9 kDa fragmenteiksi ja katkaisureaktion todettiin olevan spesifinen peptidilinkkerin histidiini alueelle. Fuusioproteiinin N-terminaalisen katkeamistuotteen sek{\"a} katkeamattoman fuusioproteiinin N-terminukset olivat vahingoittumattomat. C-terminaalisen katkeamistuotteen N-terminaalista sekvenssi{\"a} ei saatu selville, johtuen todenn{\"a}k{\"o}isesti vapaan aminoryhm{\"a}n puuttumisesta tai heterogeenisesta N-terminuksesta. Puhtaan fuusioproteiinin molekyylipainon todettiin olevan oletettua pienempi ja virhe fuusioproteiinin geeniss{\"a} tai proteiinin katkeaminen l{\"a}helt{\"a} C-terminusta fuusioproteiinin tuotossa osoittautui mandolliseksi. Kokeellisessa osassa tutkittu ilmi{\"o} on ollut tunnettu jo aiemmin, mutta sen spesifisyytt{\"a} ei ole aiemmin yritetty parantaa proteiinin muokkauksella. Nyt proteiinin spesifinen katkeaminen saavutettiin fuusioproteiiniin suunnitellusta erityisest{\"a} katkaisukohdasta. Kupari-ionien aiheuttama degradaatio pystyttiin ohjaamaan haluttuun kohtaan proteiinia histidiinijakson avulla.",
author = "Sara Heilimo",
note = "CA: BEL Diplomity{\"o} Teknillinen korkeakoulu, Kemian tekniikan osasto 93 s. + liitt. 8 s.",
year = "2005",
language = "Finnish",
publisher = "Helsinki University of Technology",
address = "Finland",
school = "Helsinki University of Technology",

}

Heilimo, S 2005, 'Fuusioproteiinien peptidiketjun katkaisu metalli-ionien avulla: Diplomityö', Master Degree, Helsinki University of Technology, Espoo.

Fuusioproteiinien peptidiketjun katkaisu metalli-ionien avulla : Diplomityö. / Heilimo, Sara.

Espoo : Helsinki University of Technology, 2005. 101 p.

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

TY - THES

T1 - Fuusioproteiinien peptidiketjun katkaisu metalli-ionien avulla

T2 - Diplomityö

AU - Heilimo, Sara

N1 - CA: BEL Diplomityö Teknillinen korkeakoulu, Kemian tekniikan osasto 93 s. + liitt. 8 s.

PY - 2005

Y1 - 2005

N2 - Työn kirjallisuusosassa on tarkasteltu fuusioproteiineja sekä fuusioproteiinitekniikan tarjoamia hyötyjä rekombinanttiproteiinien tuotossa. Fuusioproteiinien kemiallisia ja entsymaattisia katkaisumenetelmiä on tarkasteltu yksityiskohtaisesti. Kirjallisuusosassa on myös perehdytty kupari-ionien rooliin luonnossa. Metalli-ionien osallistumisesta proteiinien degradaatioon on kerrottu sekä tämän hetkiset tutkimustulokset kupari-ionien sekä rautakelaattien avulla tapahtuvasta proteiinien spesifisestä pilkkomisesta on esitelty. Työn kokeellisessa osassa tutkittiin kupari(II)ionilla tapahtuvaa fuusioproteiinin peptidiketjun katkeamisreaktiota. Fuusioproteiinin katkeaminen kahteen fuusioproteiinipartnereiden kokoa vastaaviin fragmentteihin saavutettiin kupari(II)ionin, askorbaatin sekä vetyperoksidin avulla noin tunnin inkuboinnilla. Reaktio-olosuhteiden vaikutusta katkaisureaktioon tutkittiin. Katkaisureaktion tehokkuutta sekä spesifisyyttä pystyttiin parantamaan vaihtelemalla pH:ta, puskuria, reaktiolämpötilaa, reaktioaikaa sekä suola-, kupari(II)ioni- ja vetyperoksidikonsentraatioita. Katkaisureaktion todettiin olevan nopea ja korkealla reaktiolämpötilalla oli reaktiota kiihdyttävä vaikutus. Reaktioliuoksen suolapitoisuus paransi olennaisesti reaktion spesifisyyttä. Katkaisureaktion saannon todettiin olevan heikko eikä sitä olosuhteiden parantelusta huolimatta pystytty olennaisesti parantamaan. Katkaisureaktion tarkka katkeamiskohta selvitettiin. Katkeamistuotteet erotettiin kromatografisesti ja niiden N-terminaalinen sekvenssi sekä molekyylipaino määritettiin. Katkeamisreaktiossa todettiin 73,2 kDa fuusioproteiinin pilkkoutuneen 31,2 ja 41,9 kDa fragmenteiksi ja katkaisureaktion todettiin olevan spesifinen peptidilinkkerin histidiini alueelle. Fuusioproteiinin N-terminaalisen katkeamistuotteen sekä katkeamattoman fuusioproteiinin N-terminukset olivat vahingoittumattomat. C-terminaalisen katkeamistuotteen N-terminaalista sekvenssiä ei saatu selville, johtuen todennäköisesti vapaan aminoryhmän puuttumisesta tai heterogeenisesta N-terminuksesta. Puhtaan fuusioproteiinin molekyylipainon todettiin olevan oletettua pienempi ja virhe fuusioproteiinin geenissä tai proteiinin katkeaminen läheltä C-terminusta fuusioproteiinin tuotossa osoittautui mandolliseksi. Kokeellisessa osassa tutkittu ilmiö on ollut tunnettu jo aiemmin, mutta sen spesifisyyttä ei ole aiemmin yritetty parantaa proteiinin muokkauksella. Nyt proteiinin spesifinen katkeaminen saavutettiin fuusioproteiiniin suunnitellusta erityisestä katkaisukohdasta. Kupari-ionien aiheuttama degradaatio pystyttiin ohjaamaan haluttuun kohtaan proteiinia histidiinijakson avulla.

AB - Työn kirjallisuusosassa on tarkasteltu fuusioproteiineja sekä fuusioproteiinitekniikan tarjoamia hyötyjä rekombinanttiproteiinien tuotossa. Fuusioproteiinien kemiallisia ja entsymaattisia katkaisumenetelmiä on tarkasteltu yksityiskohtaisesti. Kirjallisuusosassa on myös perehdytty kupari-ionien rooliin luonnossa. Metalli-ionien osallistumisesta proteiinien degradaatioon on kerrottu sekä tämän hetkiset tutkimustulokset kupari-ionien sekä rautakelaattien avulla tapahtuvasta proteiinien spesifisestä pilkkomisesta on esitelty. Työn kokeellisessa osassa tutkittiin kupari(II)ionilla tapahtuvaa fuusioproteiinin peptidiketjun katkeamisreaktiota. Fuusioproteiinin katkeaminen kahteen fuusioproteiinipartnereiden kokoa vastaaviin fragmentteihin saavutettiin kupari(II)ionin, askorbaatin sekä vetyperoksidin avulla noin tunnin inkuboinnilla. Reaktio-olosuhteiden vaikutusta katkaisureaktioon tutkittiin. Katkaisureaktion tehokkuutta sekä spesifisyyttä pystyttiin parantamaan vaihtelemalla pH:ta, puskuria, reaktiolämpötilaa, reaktioaikaa sekä suola-, kupari(II)ioni- ja vetyperoksidikonsentraatioita. Katkaisureaktion todettiin olevan nopea ja korkealla reaktiolämpötilalla oli reaktiota kiihdyttävä vaikutus. Reaktioliuoksen suolapitoisuus paransi olennaisesti reaktion spesifisyyttä. Katkaisureaktion saannon todettiin olevan heikko eikä sitä olosuhteiden parantelusta huolimatta pystytty olennaisesti parantamaan. Katkaisureaktion tarkka katkeamiskohta selvitettiin. Katkeamistuotteet erotettiin kromatografisesti ja niiden N-terminaalinen sekvenssi sekä molekyylipaino määritettiin. Katkeamisreaktiossa todettiin 73,2 kDa fuusioproteiinin pilkkoutuneen 31,2 ja 41,9 kDa fragmenteiksi ja katkaisureaktion todettiin olevan spesifinen peptidilinkkerin histidiini alueelle. Fuusioproteiinin N-terminaalisen katkeamistuotteen sekä katkeamattoman fuusioproteiinin N-terminukset olivat vahingoittumattomat. C-terminaalisen katkeamistuotteen N-terminaalista sekvenssiä ei saatu selville, johtuen todennäköisesti vapaan aminoryhmän puuttumisesta tai heterogeenisesta N-terminuksesta. Puhtaan fuusioproteiinin molekyylipainon todettiin olevan oletettua pienempi ja virhe fuusioproteiinin geenissä tai proteiinin katkeaminen läheltä C-terminusta fuusioproteiinin tuotossa osoittautui mandolliseksi. Kokeellisessa osassa tutkittu ilmiö on ollut tunnettu jo aiemmin, mutta sen spesifisyyttä ei ole aiemmin yritetty parantaa proteiinin muokkauksella. Nyt proteiinin spesifinen katkeaminen saavutettiin fuusioproteiiniin suunnitellusta erityisestä katkaisukohdasta. Kupari-ionien aiheuttama degradaatio pystyttiin ohjaamaan haluttuun kohtaan proteiinia histidiinijakson avulla.

M3 - Master's thesis

PB - Helsinki University of Technology

CY - Espoo

ER -

Heilimo S. Fuusioproteiinien peptidiketjun katkaisu metalli-ionien avulla: Diplomityö. Espoo: Helsinki University of Technology, 2005. 101 p.