Vanadium-haloperoksidaasit: Pro gradu

Haloperoksidaasit (EC 1.11.1) ovat entsyymejä, jotka katalysoivat pääasiallisesti halidi-ionien hapettumista hypohalisiksi hapoiksi peroksidien avulla. Lisäksi ne katalysoivat peroksidaasi-, sulfoksidaasi-ja erilaisia hapetusreaktioita. Entsyymit luokitellaan hemi- tai vanadiumhaloperoksidaaseiksi niiden sisältämän prosteettisen ryhmän perusteella. Vanadiumhaloperoksidaaseja ja niiden potentiaalia orgaanisissa synteeseissä on alettu tutkimaan tarkemmin viime aikoina. Tässä työssä tarkoituksena oli seuloa mikrobikantoja uusien haloperoksidaasituottajien löytämiseksi, optimoida tuotto, puhdistus ja karakterisoida löydettyjä entsyymejä. Tavoitteena oli löytää sopiva haloperoksidaasi, jota voitaisiin soveltaa orgaanisissa synteeseissä. Primaarinen seulonta tehtiin fenolipunan brominaatioon perustuvaa menetelmää käyttäen. Tarkempaan tutkimukseen valittiin Botryotinia sp.485 ja Streptomyces thermolineatus R4893 lajien tuottamat haloperoksidaasit. Entsyymien halogenaatioaktiivisuus määritettiin kvantitatiivisesti monoklooridimedionin (MCD) halogenaatioon perustuvalla menetelmällä. MCD-menetelmää käytettiin myös entsyymien optimiolojen määritykseen. Entsyymien peroksidaasiaktiivisuus määritettiin o-dianisidiinin hapetukseen perustuvalla menetelmällä ja katalaasiaktiivisuus vetyperoksidin hajoamiseen perustuvalla menetelmällä. Entsyymin tyyppi määritettiin EDTA/vanadaatti dialyysillä, jolla voidaan todeta haloperoksidaasien vanadium-riippuvaisuus. Entsyymien pI-arvot määritettiin isoelektrisellä fokusoinnilla. Streptomyces thermolineatus R4893 lajin tuottama haloperoksidaasi puhdistettiin tarkempia määrityksiä varten. Entsyymi eristettiin ammoniumsulfaattisaostuksella ja puhdistettiin hydrofobisella interaktiokromatografialla ja anioninvaihtokromatografialla. Osittain puhdistetusta entsyymipreparaatista määritettiin pH- ja Iämpöstabiilisuus. Kaksi eri molekyylipainon (50 ja 35 kDa) omaavaa näytettä lähetettiin aminohapposekvensointiin kaupalliseen laboratorioon. Saatuja sekvenssejä verrattiin tunnettuihin proteiineihin BLAST-ohjelman avulla. Botryotinian tuottama entsyymi oli hemi-haloperoksidaasi. Se katalysoi MCD:n klorinaatiota ja brominaatiota. Entsyymillä ei havaittu katalaasiaktiivisuutta, peroksidaasiaktiivisuutta oli halogeenien läsnäollessa seoksessa. Sen pI-arvo oli n.3.8, ja halogenaatioaktiivisuus paras pH:ssa 4.2. Entsyymi on hyvin epästabiili ja aktiivisuus alhainen, joten sen käyttö teollisiin sovelluksiin ei todennäköisesti olisi kannattavaa. S. thermolineatusin tuottama entsyymi on vanadiumbromoperoksidaasi. Entsyymillä ei ole katalaasiaktiivisuutta, peroksidaasiaktiivisuus havaittiin, kun reaktioseoksessa oli mukana bromi. Bromoperoksidaasin pI-arvo oli myös n. 3.8, ja halogenaatioaktiivisuus paras pH:ssa 4.2. Entsyymin lämmönkestävyys ei ollut kovin hyvä verrattuna tunnettuihin vanadium-haloperoksidaaseihin. Aminohapposekvensseistä voitiin päätellä, että 35 kDa:n kokoinen proteiini on 50 kDa proteiinin hajoamistuote. Sekvenssejä verrattaessa tunnettuihin proteiineihin löydettiin yhteneväisyyksia kahteen vanadium-haloperoksidaasiin. Vanadiumriippuvaisuus tekee entsyymistä merkityksellisen, koska aiemmin ei ole raportoitu prokaryoottista alkuperää olevasta haloperoksidaasista. Entsyymin tuotto on melko vähäistä, joten jatkossa tulisi sekvensoida proteiinia koodaava geeni ja kloonata se sopivaan ylituottokantaan. Tällöin saataisiin preparaatti ominaisuuksien tarkempaa määritystä, rakenteen tutkimista, sekä sovelluksia varten