Vanadium-haloperoksidaasit: Pro gradu

Translated title of the contribution: Vanadium haloperoxidases: Master's thesis

Terhi Kotilainen

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

Abstract

Haloperoksidaasit (EC 1.11.1) ovat entsyymejä, jotka katalysoivat pääasiallisesti halidi-ionien hapettumista hypohalisiksi hapoiksi peroksidien avulla. Lisäksi ne katalysoivat peroksidaasi-, sulfoksidaasi-ja erilaisia hapetusreaktioita. Entsyymit luokitellaan hemi- tai vanadiumhaloperoksidaaseiksi niiden sisältämän prosteettisen ryhmän perusteella. Vanadiumhaloperoksidaaseja ja niiden potentiaalia orgaanisissa synteeseissä on alettu tutkimaan tarkemmin viime aikoina. Tässä työssä tarkoituksena oli seuloa mikrobikantoja uusien haloperoksidaasituottajien löytämiseksi, optimoida tuotto, puhdistus ja karakterisoida löydettyjä entsyymejä. Tavoitteena oli löytää sopiva haloperoksidaasi, jota voitaisiin soveltaa orgaanisissa synteeseissä. Primaarinen seulonta tehtiin fenolipunan brominaatioon perustuvaa menetelmää käyttäen. Tarkempaan tutkimukseen valittiin Botryotinia sp.485 ja Streptomyces thermolineatus R4893 lajien tuottamat haloperoksidaasit. Entsyymien halogenaatioaktiivisuus määritettiin kvantitatiivisesti monoklooridimedionin (MCD) halogenaatioon perustuvalla menetelmällä. MCD-menetelmää käytettiin myös entsyymien optimiolojen määritykseen. Entsyymien peroksidaasiaktiivisuus määritettiin o-dianisidiinin hapetukseen perustuvalla menetelmällä ja katalaasiaktiivisuus vetyperoksidin hajoamiseen perustuvalla menetelmällä. Entsyymin tyyppi määritettiin EDTA/vanadaatti dialyysillä, jolla voidaan todeta haloperoksidaasien vanadium-riippuvaisuus. Entsyymien pI-arvot määritettiin isoelektrisellä fokusoinnilla. Streptomyces thermolineatus R4893 lajin tuottama haloperoksidaasi puhdistettiin tarkempia määrityksiä varten. Entsyymi eristettiin ammoniumsulfaattisaostuksella ja puhdistettiin hydrofobisella interaktiokromatografialla ja anioninvaihtokromatografialla. Osittain puhdistetusta entsyymipreparaatista määritettiin pH- ja Iämpöstabiilisuus. Kaksi eri molekyylipainon (50 ja 35 kDa) omaavaa näytettä lähetettiin aminohapposekvensointiin kaupalliseen laboratorioon. Saatuja sekvenssejä verrattiin tunnettuihin proteiineihin BLAST-ohjelman avulla. Botryotinian tuottama entsyymi oli hemi-haloperoksidaasi. Se katalysoi MCD:n klorinaatiota ja brominaatiota. Entsyymillä ei havaittu katalaasiaktiivisuutta, peroksidaasiaktiivisuutta oli halogeenien läsnäollessa seoksessa. Sen pI-arvo oli n.3.8, ja halogenaatioaktiivisuus paras pH:ssa 4.2. Entsyymi on hyvin epästabiili ja aktiivisuus alhainen, joten sen käyttö teollisiin sovelluksiin ei todennäköisesti olisi kannattavaa. S. thermolineatusin tuottama entsyymi on vanadiumbromoperoksidaasi. Entsyymillä ei ole katalaasiaktiivisuutta, peroksidaasiaktiivisuus havaittiin, kun reaktioseoksessa oli mukana bromi. Bromoperoksidaasin pI-arvo oli myös n. 3.8, ja halogenaatioaktiivisuus paras pH:ssa 4.2. Entsyymin lämmönkestävyys ei ollut kovin hyvä verrattuna tunnettuihin vanadium-haloperoksidaaseihin. Aminohapposekvensseistä voitiin päätellä, että 35 kDa:n kokoinen proteiini on 50 kDa proteiinin hajoamistuote. Sekvenssejä verrattaessa tunnettuihin proteiineihin löydettiin yhteneväisyyksia kahteen vanadium-haloperoksidaasiin. Vanadiumriippuvaisuus tekee entsyymistä merkityksellisen, koska aiemmin ei ole raportoitu prokaryoottista alkuperää olevasta haloperoksidaasista. Entsyymin tuotto on melko vähäistä, joten jatkossa tulisi sekvensoida proteiinia koodaava geeni ja kloonata se sopivaan ylituottokantaan. Tällöin saataisiin preparaatti ominaisuuksien tarkempaa määritystä, rakenteen tutkimista, sekä sovelluksia varten
Original languageFinnish
QualificationMaster Degree
Awarding Institution
  • University of Helsinki
Place of PublicationHelsinki
Publisher
Publication statusPublished - 2004
MoE publication typeG2 Master's thesis, polytechnic Master's thesis

Fingerprint

Streptomyces thermolineatus
vanadium
Botryotinia
Bromus
peroxidases
chloride peroxidase

Keywords

  • haloperoksidaasi
  • halogenaatio
  • sulfoksidaatio
  • vanadium-haloperoksidaasi
  • haloperoxidase
  • halogenation
  • sulfoxidation
  • vanadium haloperoxidase

Cite this

Kotilainen, T. (2004). Vanadium-haloperoksidaasit: Pro gradu. Helsinki: University of Helsinki.
Kotilainen, Terhi. / Vanadium-haloperoksidaasit : Pro gradu. Helsinki : University of Helsinki, 2004. 63 p.
@phdthesis{e67fb9a829da4d6b8fb8684e6b71ca50,
title = "Vanadium-haloperoksidaasit: Pro gradu",
abstract = "Haloperoksidaasit (EC 1.11.1) ovat entsyymej{\"a}, jotka katalysoivat p{\"a}{\"a}asiallisesti halidi-ionien hapettumista hypohalisiksi hapoiksi peroksidien avulla. Lis{\"a}ksi ne katalysoivat peroksidaasi-, sulfoksidaasi-ja erilaisia hapetusreaktioita. Entsyymit luokitellaan hemi- tai vanadiumhaloperoksidaaseiksi niiden sis{\"a}lt{\"a}m{\"a}n prosteettisen ryhm{\"a}n perusteella. Vanadiumhaloperoksidaaseja ja niiden potentiaalia orgaanisissa synteeseiss{\"a} on alettu tutkimaan tarkemmin viime aikoina. T{\"a}ss{\"a} ty{\"o}ss{\"a} tarkoituksena oli seuloa mikrobikantoja uusien haloperoksidaasituottajien l{\"o}yt{\"a}miseksi, optimoida tuotto, puhdistus ja karakterisoida l{\"o}ydettyj{\"a} entsyymej{\"a}. Tavoitteena oli l{\"o}yt{\"a}{\"a} sopiva haloperoksidaasi, jota voitaisiin soveltaa orgaanisissa synteeseiss{\"a}. Primaarinen seulonta tehtiin fenolipunan brominaatioon perustuvaa menetelm{\"a}{\"a} k{\"a}ytt{\"a}en. Tarkempaan tutkimukseen valittiin Botryotinia sp.485 ja Streptomyces thermolineatus R4893 lajien tuottamat haloperoksidaasit. Entsyymien halogenaatioaktiivisuus m{\"a}{\"a}ritettiin kvantitatiivisesti monoklooridimedionin (MCD) halogenaatioon perustuvalla menetelm{\"a}ll{\"a}. MCD-menetelm{\"a}{\"a} k{\"a}ytettiin my{\"o}s entsyymien optimiolojen m{\"a}{\"a}ritykseen. Entsyymien peroksidaasiaktiivisuus m{\"a}{\"a}ritettiin o-dianisidiinin hapetukseen perustuvalla menetelm{\"a}ll{\"a} ja katalaasiaktiivisuus vetyperoksidin hajoamiseen perustuvalla menetelm{\"a}ll{\"a}. Entsyymin tyyppi m{\"a}{\"a}ritettiin EDTA/vanadaatti dialyysill{\"a}, jolla voidaan todeta haloperoksidaasien vanadium-riippuvaisuus. Entsyymien pI-arvot m{\"a}{\"a}ritettiin isoelektrisell{\"a} fokusoinnilla. Streptomyces thermolineatus R4893 lajin tuottama haloperoksidaasi puhdistettiin tarkempia m{\"a}{\"a}rityksi{\"a} varten. Entsyymi eristettiin ammoniumsulfaattisaostuksella ja puhdistettiin hydrofobisella interaktiokromatografialla ja anioninvaihtokromatografialla. Osittain puhdistetusta entsyymipreparaatista m{\"a}{\"a}ritettiin pH- ja I{\"a}mp{\"o}stabiilisuus. Kaksi eri molekyylipainon (50 ja 35 kDa) omaavaa n{\"a}ytett{\"a} l{\"a}hetettiin aminohapposekvensointiin kaupalliseen laboratorioon. Saatuja sekvenssej{\"a} verrattiin tunnettuihin proteiineihin BLAST-ohjelman avulla. Botryotinian tuottama entsyymi oli hemi-haloperoksidaasi. Se katalysoi MCD:n klorinaatiota ja brominaatiota. Entsyymill{\"a} ei havaittu katalaasiaktiivisuutta, peroksidaasiaktiivisuutta oli halogeenien l{\"a}sn{\"a}ollessa seoksessa. Sen pI-arvo oli n.3.8, ja halogenaatioaktiivisuus paras pH:ssa 4.2. Entsyymi on hyvin ep{\"a}stabiili ja aktiivisuus alhainen, joten sen k{\"a}ytt{\"o} teollisiin sovelluksiin ei todenn{\"a}k{\"o}isesti olisi kannattavaa. S. thermolineatusin tuottama entsyymi on vanadiumbromoperoksidaasi. Entsyymill{\"a} ei ole katalaasiaktiivisuutta, peroksidaasiaktiivisuus havaittiin, kun reaktioseoksessa oli mukana bromi. Bromoperoksidaasin pI-arvo oli my{\"o}s n. 3.8, ja halogenaatioaktiivisuus paras pH:ssa 4.2. Entsyymin l{\"a}mm{\"o}nkest{\"a}vyys ei ollut kovin hyv{\"a} verrattuna tunnettuihin vanadium-haloperoksidaaseihin. Aminohapposekvensseist{\"a} voitiin p{\"a}{\"a}tell{\"a}, ett{\"a} 35 kDa:n kokoinen proteiini on 50 kDa proteiinin hajoamistuote. Sekvenssej{\"a} verrattaessa tunnettuihin proteiineihin l{\"o}ydettiin yhtenev{\"a}isyyksia kahteen vanadium-haloperoksidaasiin. Vanadiumriippuvaisuus tekee entsyymist{\"a} merkityksellisen, koska aiemmin ei ole raportoitu prokaryoottista alkuper{\"a}{\"a} olevasta haloperoksidaasista. Entsyymin tuotto on melko v{\"a}h{\"a}ist{\"a}, joten jatkossa tulisi sekvensoida proteiinia koodaava geeni ja kloonata se sopivaan ylituottokantaan. T{\"a}ll{\"o}in saataisiin preparaatti ominaisuuksien tarkempaa m{\"a}{\"a}rityst{\"a}, rakenteen tutkimista, sek{\"a} sovelluksia varten",
keywords = "haloperoksidaasi, halogenaatio, sulfoksidaatio, vanadium-haloperoksidaasi, haloperoxidase, halogenation, sulfoxidation, vanadium haloperoxidase",
author = "Terhi Kotilainen",
note = "CA: BEL OH: pro gradu Helsingin yliopisto, Bio- ja ymp{\"a}rist{\"o}tieteiden laitos, Biokemian osasto 63 s.",
year = "2004",
language = "Finnish",
publisher = "University of Helsinki",
address = "Finland",
school = "University of Helsinki",

}

Kotilainen, T 2004, 'Vanadium-haloperoksidaasit: Pro gradu', Master Degree, University of Helsinki, Helsinki.

Vanadium-haloperoksidaasit : Pro gradu. / Kotilainen, Terhi.

Helsinki : University of Helsinki, 2004. 63 p.

Research output: ThesisMaster's thesisTheses

TY - THES

T1 - Vanadium-haloperoksidaasit

T2 - Pro gradu

AU - Kotilainen, Terhi

N1 - CA: BEL OH: pro gradu Helsingin yliopisto, Bio- ja ympäristötieteiden laitos, Biokemian osasto 63 s.

PY - 2004

Y1 - 2004

N2 - Haloperoksidaasit (EC 1.11.1) ovat entsyymejä, jotka katalysoivat pääasiallisesti halidi-ionien hapettumista hypohalisiksi hapoiksi peroksidien avulla. Lisäksi ne katalysoivat peroksidaasi-, sulfoksidaasi-ja erilaisia hapetusreaktioita. Entsyymit luokitellaan hemi- tai vanadiumhaloperoksidaaseiksi niiden sisältämän prosteettisen ryhmän perusteella. Vanadiumhaloperoksidaaseja ja niiden potentiaalia orgaanisissa synteeseissä on alettu tutkimaan tarkemmin viime aikoina. Tässä työssä tarkoituksena oli seuloa mikrobikantoja uusien haloperoksidaasituottajien löytämiseksi, optimoida tuotto, puhdistus ja karakterisoida löydettyjä entsyymejä. Tavoitteena oli löytää sopiva haloperoksidaasi, jota voitaisiin soveltaa orgaanisissa synteeseissä. Primaarinen seulonta tehtiin fenolipunan brominaatioon perustuvaa menetelmää käyttäen. Tarkempaan tutkimukseen valittiin Botryotinia sp.485 ja Streptomyces thermolineatus R4893 lajien tuottamat haloperoksidaasit. Entsyymien halogenaatioaktiivisuus määritettiin kvantitatiivisesti monoklooridimedionin (MCD) halogenaatioon perustuvalla menetelmällä. MCD-menetelmää käytettiin myös entsyymien optimiolojen määritykseen. Entsyymien peroksidaasiaktiivisuus määritettiin o-dianisidiinin hapetukseen perustuvalla menetelmällä ja katalaasiaktiivisuus vetyperoksidin hajoamiseen perustuvalla menetelmällä. Entsyymin tyyppi määritettiin EDTA/vanadaatti dialyysillä, jolla voidaan todeta haloperoksidaasien vanadium-riippuvaisuus. Entsyymien pI-arvot määritettiin isoelektrisellä fokusoinnilla. Streptomyces thermolineatus R4893 lajin tuottama haloperoksidaasi puhdistettiin tarkempia määrityksiä varten. Entsyymi eristettiin ammoniumsulfaattisaostuksella ja puhdistettiin hydrofobisella interaktiokromatografialla ja anioninvaihtokromatografialla. Osittain puhdistetusta entsyymipreparaatista määritettiin pH- ja Iämpöstabiilisuus. Kaksi eri molekyylipainon (50 ja 35 kDa) omaavaa näytettä lähetettiin aminohapposekvensointiin kaupalliseen laboratorioon. Saatuja sekvenssejä verrattiin tunnettuihin proteiineihin BLAST-ohjelman avulla. Botryotinian tuottama entsyymi oli hemi-haloperoksidaasi. Se katalysoi MCD:n klorinaatiota ja brominaatiota. Entsyymillä ei havaittu katalaasiaktiivisuutta, peroksidaasiaktiivisuutta oli halogeenien läsnäollessa seoksessa. Sen pI-arvo oli n.3.8, ja halogenaatioaktiivisuus paras pH:ssa 4.2. Entsyymi on hyvin epästabiili ja aktiivisuus alhainen, joten sen käyttö teollisiin sovelluksiin ei todennäköisesti olisi kannattavaa. S. thermolineatusin tuottama entsyymi on vanadiumbromoperoksidaasi. Entsyymillä ei ole katalaasiaktiivisuutta, peroksidaasiaktiivisuus havaittiin, kun reaktioseoksessa oli mukana bromi. Bromoperoksidaasin pI-arvo oli myös n. 3.8, ja halogenaatioaktiivisuus paras pH:ssa 4.2. Entsyymin lämmönkestävyys ei ollut kovin hyvä verrattuna tunnettuihin vanadium-haloperoksidaaseihin. Aminohapposekvensseistä voitiin päätellä, että 35 kDa:n kokoinen proteiini on 50 kDa proteiinin hajoamistuote. Sekvenssejä verrattaessa tunnettuihin proteiineihin löydettiin yhteneväisyyksia kahteen vanadium-haloperoksidaasiin. Vanadiumriippuvaisuus tekee entsyymistä merkityksellisen, koska aiemmin ei ole raportoitu prokaryoottista alkuperää olevasta haloperoksidaasista. Entsyymin tuotto on melko vähäistä, joten jatkossa tulisi sekvensoida proteiinia koodaava geeni ja kloonata se sopivaan ylituottokantaan. Tällöin saataisiin preparaatti ominaisuuksien tarkempaa määritystä, rakenteen tutkimista, sekä sovelluksia varten

AB - Haloperoksidaasit (EC 1.11.1) ovat entsyymejä, jotka katalysoivat pääasiallisesti halidi-ionien hapettumista hypohalisiksi hapoiksi peroksidien avulla. Lisäksi ne katalysoivat peroksidaasi-, sulfoksidaasi-ja erilaisia hapetusreaktioita. Entsyymit luokitellaan hemi- tai vanadiumhaloperoksidaaseiksi niiden sisältämän prosteettisen ryhmän perusteella. Vanadiumhaloperoksidaaseja ja niiden potentiaalia orgaanisissa synteeseissä on alettu tutkimaan tarkemmin viime aikoina. Tässä työssä tarkoituksena oli seuloa mikrobikantoja uusien haloperoksidaasituottajien löytämiseksi, optimoida tuotto, puhdistus ja karakterisoida löydettyjä entsyymejä. Tavoitteena oli löytää sopiva haloperoksidaasi, jota voitaisiin soveltaa orgaanisissa synteeseissä. Primaarinen seulonta tehtiin fenolipunan brominaatioon perustuvaa menetelmää käyttäen. Tarkempaan tutkimukseen valittiin Botryotinia sp.485 ja Streptomyces thermolineatus R4893 lajien tuottamat haloperoksidaasit. Entsyymien halogenaatioaktiivisuus määritettiin kvantitatiivisesti monoklooridimedionin (MCD) halogenaatioon perustuvalla menetelmällä. MCD-menetelmää käytettiin myös entsyymien optimiolojen määritykseen. Entsyymien peroksidaasiaktiivisuus määritettiin o-dianisidiinin hapetukseen perustuvalla menetelmällä ja katalaasiaktiivisuus vetyperoksidin hajoamiseen perustuvalla menetelmällä. Entsyymin tyyppi määritettiin EDTA/vanadaatti dialyysillä, jolla voidaan todeta haloperoksidaasien vanadium-riippuvaisuus. Entsyymien pI-arvot määritettiin isoelektrisellä fokusoinnilla. Streptomyces thermolineatus R4893 lajin tuottama haloperoksidaasi puhdistettiin tarkempia määrityksiä varten. Entsyymi eristettiin ammoniumsulfaattisaostuksella ja puhdistettiin hydrofobisella interaktiokromatografialla ja anioninvaihtokromatografialla. Osittain puhdistetusta entsyymipreparaatista määritettiin pH- ja Iämpöstabiilisuus. Kaksi eri molekyylipainon (50 ja 35 kDa) omaavaa näytettä lähetettiin aminohapposekvensointiin kaupalliseen laboratorioon. Saatuja sekvenssejä verrattiin tunnettuihin proteiineihin BLAST-ohjelman avulla. Botryotinian tuottama entsyymi oli hemi-haloperoksidaasi. Se katalysoi MCD:n klorinaatiota ja brominaatiota. Entsyymillä ei havaittu katalaasiaktiivisuutta, peroksidaasiaktiivisuutta oli halogeenien läsnäollessa seoksessa. Sen pI-arvo oli n.3.8, ja halogenaatioaktiivisuus paras pH:ssa 4.2. Entsyymi on hyvin epästabiili ja aktiivisuus alhainen, joten sen käyttö teollisiin sovelluksiin ei todennäköisesti olisi kannattavaa. S. thermolineatusin tuottama entsyymi on vanadiumbromoperoksidaasi. Entsyymillä ei ole katalaasiaktiivisuutta, peroksidaasiaktiivisuus havaittiin, kun reaktioseoksessa oli mukana bromi. Bromoperoksidaasin pI-arvo oli myös n. 3.8, ja halogenaatioaktiivisuus paras pH:ssa 4.2. Entsyymin lämmönkestävyys ei ollut kovin hyvä verrattuna tunnettuihin vanadium-haloperoksidaaseihin. Aminohapposekvensseistä voitiin päätellä, että 35 kDa:n kokoinen proteiini on 50 kDa proteiinin hajoamistuote. Sekvenssejä verrattaessa tunnettuihin proteiineihin löydettiin yhteneväisyyksia kahteen vanadium-haloperoksidaasiin. Vanadiumriippuvaisuus tekee entsyymistä merkityksellisen, koska aiemmin ei ole raportoitu prokaryoottista alkuperää olevasta haloperoksidaasista. Entsyymin tuotto on melko vähäistä, joten jatkossa tulisi sekvensoida proteiinia koodaava geeni ja kloonata se sopivaan ylituottokantaan. Tällöin saataisiin preparaatti ominaisuuksien tarkempaa määritystä, rakenteen tutkimista, sekä sovelluksia varten

KW - haloperoksidaasi

KW - halogenaatio

KW - sulfoksidaatio

KW - vanadium-haloperoksidaasi

KW - haloperoxidase

KW - halogenation

KW - sulfoxidation

KW - vanadium haloperoxidase

M3 - Master's thesis

PB - University of Helsinki

CY - Helsinki

ER -

Kotilainen T. Vanadium-haloperoksidaasit: Pro gradu. Helsinki: University of Helsinki, 2004. 63 p.